Biotechnologische Gewinnung von Cyathan-Diterpenoiden

Abstract

Basidiomyceten produzieren vielfältige biologisch aktive Sekundärmetabolite, unter anderem seltene niedermolekulare Terpenoide, welche ein enormes Potenzial in der pharma¬zeutischen Industrie besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden Unter¬suchungen zu Cyathan-Diterpenoiden aus den Basidiomyceten-Arten Cyathus striatus (FU04405) und Hericium erinaceus (FU70034) durch-geführt. Letzterer ist als Produzent von verschiedenen Erinacinen bekannt. Die Erinacin C-Produktion war bei dem verwendeten Stamm stark substrat¬abhängig. Das ZM1/2-Medium mit 0,5 g L-1 Edamin® K erwies sich dafür als am besten geeignet. Die maximale Konzentration an Erinacin C betrug ca. 257 mg L-1 Medium mit einer Kultivierungs¬dauer von 9 Tagen. Die Produktion von Erinacin P war stark zeit¬abhängig. Die maximale Konzentration von 184 mg L-1 Medium wurde am Tag 3 erreicht. Eine UV-A-Bestrahlung während der Kultivierung wirkte sich sowohl auf das Biomasse¬wachstum, als auch auf die Bildung der Erinacine negativ aus. Des Weiteren wurden die Striatale A/B/C/D und die Striatine A/B aus Submers-kulturen von C. striatus isoliert. Aus Submerskulturen von H. erinaceus wurden die Erinacine C/F/P, 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (neu entdeckter Metabolit), eine unbekannte Substanz mit der Summenformel C18H21NO5 und vier unbekannte Meroterpenoide C27H29NO7, C42H50N2O12, C24H31NO7 und C23H29NO7 (neu entdeckte Metaboliten) isoliert. Aus den Fruchtkörpern von H. erinaceus wurden Hericenon B und Hericerin isoliert. Mittels MALDI-MS-Imaging konnte nachgewiesen werden, dass die Striatale und Erinacine innerhalb eines Pellets lokalisiert sind. Durch den Einsatz einer kontinuierlich arbeitenden Rührwerkskugelmühle zum Zellaufschluss konnten die Produktausbeuten um 89% (Striatale A und B) bzw. um 53% (Erinacin C) gesteigert werden. Für die untersuchten Basidiomyceten erwies sich damit der Zellaufschluss mittels Rührwerks¬kugelmühle zur Freisetzung der Sekundär-metabolite als hocheffizient. Darüber hinaus wurde ein indirekt kompetitiver ELISA zum Nachweis der Cyathan-Diterpenoide entwickelt. Verschiedene Einflussfaktoren auf den Assay wie pH Wert, Temperatur, Dauer der Beschichtung sowie die Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln wurden untersucht. Die Kreuzreaktivitäten der Striatale A/C/D, der Striatine A/B und der Erinacine C/P gegen Striatal B wurden ebenfalls ermittelt. Zusätzlich wurde der hier etablierte ELISA in biologischen Proben zum Screening nach Cyathan-Derivaten eingesetzt. Dabei wurden Kreuz¬reaktivitäten in den Rohextrakten der Kulturüberstände aus Submerskulturen von H. erinaceus nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigte ein Rohextrakt aus Fruchtkörpern von H. erinaceus keine signifikante Antigen-Antikörper-Reaktion. Anhand der Wieder¬findungs¬rate konnte eine hohe Sensitivität, eine ausreichende Genauigkeit und eine gute Korrelation des ELISA mit den HPLC-DAD-Messungen aufgezeigt werden.Mittels HPTLC wurden vergleichbare Ergebnisse bezüglich Produktbildungskinetik wie mit Hilfe der HPLC erzielt. Die HPTLC bietet zusätzlich die Möglichkeit, die Sekundärmetabolite über die Bioautographie auf Bioaktivität zu überprüfen. Fungi of the phylum Basidiomycota are well known to form a broad spectrum of biologically active secondary metabolites, especially low molecular weight compounds such as terpenoids. In the present work, two species, Cyathus striatus (FU04405) and Hericium erinaceus (FU70034), were studied, focusing on the rare cyathane diterpenoids formed in submerged cultures. H. erinaceus is a known producer of various erinacines. It was shown that the production of erinacine C strongly depended on the culture substrates. ZM1/2-medium with 0.5 g L 1 Edamin® K proved to be the best medium for erinacine C production. The highest concentration was obtained on the 9th culture day (approximately 257 mg L-1). The production of erinacine P was strongly time dependent. While the concentration of erinacine P was decreasing, the erinacine C concentration increased steadily. The application of UV-A light showed negative effects on both, mycelium growth and secondary metabolite production. Furthermore, secondary metabolites such as the striatals A, B, C, and D, and striatins A and B from submerged cultures of C. striatus, the erinacines C, F and P, 4-chloro-3,5-dimethoxy benzoic acid (novel natural product), an unknown metabolite with a sum formula of C18H21NO5, and four unknown meroterpenoids with sum formulas of C27H29NO7, C42H50N2O12, C24H31NO7 and C23H29NO7 (novel natural products) from submerged cultures of H. erinaceus could be purified by preparative HPLC.Regarding the localization of the low molecular secondary metabolites in basidiomycetes, MALDI-MS-Imaging and different cell disruption techniques were applied. Thus it could be shown that cyathane diterpenoids are located within the mycelial pellets. The use of a glass bead mill for releasing secondary metabolites from basidio¬mycetes proved to be highly efficient. With this technique, the yields of striatals were increased up to 89% and of erinacine C up to 53%. Additionally, an indirect competitive ELISA was developed for the detection of cyathane diterpenoids. Different factors influencing the ELISA were studied (e.g. pH, temperature, time of coating, tolerance of organic solvents). The cross reactivities of the striatals A, C and D, the striatins A and B, and the erinacines C and P against striatal B were determined. The presence of cyathane diterpenoids in submerged cultures of H. erinaceus was proved by means of the developed indirect competitive ELISA. In contrast, it did not show cross reactivity with extracts from fruiting bodies, which implied the absence or the presence of only trace amounts of erinacines in fruiting bodies. A good correlation between data from the ELISA and the HPLC-DAD measurements could be shown. Similar results for product formation kinetics, maximal UV absorption and mass spectrometric data could be obtained via HPTLC and HPLC-DAD. HPTLC allowed the additional analysis of biological activity of the analytes if combined with bioautographic techniques.