Synthese farbstoffmarkierter Gliadinpeptide zur Untersuchung intrazellulärer Transportprozesse im Rahmen von Zöliakie

Abstract

Mit einer Prävalenz von 1% ist Zöliakie (Glutenunverträglichkeit) eine der häufigsten Autoimmunerkrankungen des Gastrointestinaltrakts. Durch Aufnahme von Gluten über die Nahrung leiden genetisch prädisponierte Personen an einer Entzündungsreaktion im Dünndarm. Die Arbeitsgruppe um Zimmer et al. vermutet, dass toxische Gliadinpeptide während des intestinalen Transportwegs in den EE verbleiben und nicht in die LE transportiert werden, wodurch die Entwicklung einer oralen Immuntoleranz ausbleibt. Es ist bekannt, dass durch Konjugation an CTB der Transport in die LE mittels GM1-Rezeptor-vermittelter Endocytose erfolgt.Die vorliegende Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Synthese farbstoffmarkierter Gliadinpeptide und der Untersuchung ihres intrazellulären Transportwegs und ist ein Kooperationsprojekt mit der Arbeitsgruppe von Prof. Zimmer aus der Abteilung für Pädiatrie und Neonatologie am Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen. Die Syntheseroute beginnt mit der Darstellung von immunodominanten und toxischen Gliadinpeptiden mittels linearer SPPS gemäß der Fmoc-Strategie und ihrer Markierung mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen. Mit Hilfe der Fluoreszenzmarkierung konnte die Aufnahme der Gliadinpeptide in Caco-2-Zellen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie anhand eines Live Imagings verfolgt werden. Dass die Gliadinpeptid-Aufnahme tatsächlich über Endocytose erfolgt, konnte durch die Temperaturabhängigkeit der Peptidaufnahme gezeigt werden. In einem weiteren Experiment wurde mit Hilfe eines Transwellsystems untersucht, ob und wie das intestinale Epithel eine Rolle bei der Prozessierung von Gliadinpeptiden spielt. Es konnte gezeigt werden, dass beide fluoreszenzmarkierten Peptide p31-43 und p56-68 befähigt waren in Abhängigkeit von Konzentration, Temperatur und Inkubationsdauer eine intakte Monoschicht aus Caco-2-Zellen zu passieren, wobei bei p31-43 die Aufnahme mittels Endocytose bevorzugt war. Durch MALDI-TOF-Analysen nachgewiesene strukturelle Veränderungen der Peptide deuten auf eine Degradation durch Peptidasen auf der Oberfläche von Caco-2-Zellen hin. Bei der Darstellung eines CTB-Gliadinpeptid-Konjugats ist der Einbau eines selektiv spaltbaren Linkers notwendig, um das native Peptid nach dem Transport in die LE wieder freizusetzen, so dass es den Zellen des Immunsystems präsentiert werden kann. CatD befindet sich in höherer Konzentration in den LE und spaltet selektiv die Bindung zwischen zwei hydrophoben Aminosäuren innerhalb einer Polypeptidkette. Acht verschiedene Peptide wurden einem Inkubationsexperiment mit voraktiviertem CatD bei pH = 3.5 für 8 h unterzogen. Dabei wurden die meisten Substrate an den bevorzugten Stellen gespalten. Auch das toxische Gliadinpeptid p31-43, dessen Sequenz mit dem peptidischen, CatD-labilen Linker Ac-AAALA verlängert wurde, lieferte das erwartete Spaltfragment, wenn auch in geringer Konzentration. Interessant war dabei der Nachweis von weiteren Fragmenten, die Spaltprodukten des nativen Gliadinpeptids entsprachen. Offenbar ist die Degradation von Gliadinpeptiden, welche laut Literatur aufgrund des hohen Prolinanteils nicht bzw. nicht vollständig durch gastrointestinale Enzyme hydrolisiert werden, durchaus möglich, sofern sie in die LE gelangen.Dass prinzipiell Moleküle mit einer Maleimidfunktionalität für die Konjugation mit CTB geeignet sind, konnte erfolgreich mit dem bifunktionalen Linker MHS gezeigt werden. Der Einbau einer zusätzlichen Lysin-Einheit wiederum ermöglichte die Markierung mit dem PromoFluor-Farbstoff über die freie NH2-Gruppe in der Lysin-Seitenkette. Das so modifizierte, toxische Gliadinpeptid konnte in vier Schritten mit einer Gesamtausbeute von 23% dargestellt werden. Der anschließende Versuch zur Konjugation mit CTB gelang jedoch nicht, so dass eine Optimierung der Konjugationsreaktion Ziel zukünftiger Arbeiten darstellen sollte. Bei dem Verfahren der indirekten Immunofluoreszenz-Mikroskopie wurde der Zellkern von Caco-2-Zellen, sowie Zellorganelle des endosomalen Kompartimentes mit Hilfe einer Doppelmarkierungstechnik fluoreszenzmarkiert, um Aussagen über die Lokalisation von Gliadinpeptiden in EE oder LE zu treffen. Als Ergebnis ist hervorzuheben, dass es sich bei dem immunohistochemischen Verfahren zwingend um eine Rezeptor-vermittelte Antigenaufnahme handeln sollte. Ansonsten wird durch Fixierung und anschließende Permeabilisierung der Zellen, wobei bei letzterem Schritt Löcher in der Zellmembran erzeugt werden, offenbar das fluoreszenzmarkierte Gliadinpeptid aus den Zellen heraus gespült. Somit lag häufig keine ausreichende Menge des Gliadinpeptids vor, um eine evtl. vorliegende Co-Lokalisation anzuzeigen. Nach der erfolgreichen Darstellung eines CTB-Gliadinpeptid-Konjugats hingegen, könnte - aufgrund einer GM1-Rezeptor-vermittelten Endocytose des Antigens - problemlos eine Aussage über die Lokalisation des toxischen Peptids p31-43 getroffen werden. Diagnosed in approximately 1% of the Western population celiac disease is one of the most common autoimmune diseases of the gastrointestinal tract. The ingestion of gluten leads to a chronic inflammation of the small intestine in disease-susceptible individuals. The working group of Zimmer et al. hypothesizes, that toxic gliadin peptids bypass HLA-DR-positive LE in intestinal cells, but are mainly localized in the EE resulting in a breakdown in oral tolerance. The conjugation of toxic gliadin peptids to CTB, a protein well known for its function as a carrier of immunization when coupled to an antigen, could redirect the peptids into the LE, thus offering a promising therapeutic approach in the treatment of celiac disease.This project presents the synthesis of dye-labeled gliadin peptids and the measurement of their intracellular transport pathways in co-operation with the working group of Prof. Zimmer in the Department of Pediatrics. The synthetic route starts with the synthesis of immunogenic and toxic gliadin peptids by linear SPPS according to the Fmoc-strategy and their labeling with two different fluorescent dyes. By labeling the gliadin peptids with a fluorescent dye the measurement of their absorption by Caco-2 cells can be accomplished in a Live Imaging using confocal fluorescence microscopy. In a further experiment the mechanism of translocation and processing of gliadin peptids by enterocytes was studied. Therefore, a transwell system was used with postconfluent and differentiated polarized Caco-2 cells, a human intestinal epithelial cell line. It was observed that both dye-labeled peptids p31-43 and p56-68 are able to cross the intact monolayer of Caco-2 cells into the basolateral compartment in a concentration-, temperature- and time-dependent manner, p31-43 preferring the uptake by endocytosis. For the design of a gliadin peptide-CTB conjugate the incorporation of a selectively cleavable linker is necessary, in order to release the free peptide again, which then can be presented to regulatory T cells of the immune system. CatD, a major intracellular aspartic protease, which is present in the LE predominatly, cleaves the peptide bond between two hydrophobic amino acids within a polypeptide chain. In order to investigate whether the peptidic substrates were cleaved by CatD a digest assay with activated CatD at pH = 3.5 for 8 h was accomplished. Most of the substrates were cleaved at the expected cleavage sites. The cleavage profile of the toxic gliadin peptide p31-43, incorporating the CatD-labile linker Ac-AAALA, also showed the formation of the expected cleavage product. Interestingly the cleavage profile additionally showed the formation of several other fragments indicating that the toxic gliadin peptide itself was attributed to unspecific hydrolysis. Obviously gliadin peptids, which were regarded as stable towards hydrolysis by gastrointestinal enzymes, can be degraded if they are transported into the late endosomes. That principally molecules with a maleimide functionality are suitable for the conjugation with CTB, could successfully be shown with the bifunctional MHS linker. Introduction of the PromoFluor488-dye via the & #949;-amino group of an additionally added lysine, was realized. The so modified toxic gliadin peptide was obtained in four steps with an overall yield of 23%. The following attempt to conjugate latter with CTB was not successful, unfortunately. The improvement of this reaction should be the aim of work in the future.In order to investigate whether gliadin peptids are localized in the EE or LE indirect immunofluorescence microscopy was accomplished, where the nucleus and the cell organelles were marked with dye-labeled antibodies. For this experiment a receptor-mediated uptake of the antigen is necessary, otherwise the gliadin peptids are washed out the cells during the preparing procedures for the immunofluorescence assay. Therefore, the amount of dye-labeled gliadin peptids internalized by the Caco-2 cells were not sufficient to indicate a possibly existing co-localisation. In contrast, the toxic gliadin peptide p31-43 conjugated to CTB, which is absorbed by GM1-receptor-mediated endocytosis, could deliver evidence of the localization of the toxic peptide without problems.