Auswirkungen des synergistischen Effekts der Kombination von Sildenafil und Imatinib auf den SMAD-Signalweg bei pulmonaler Hypertonie

Abstract

Pulmonalarterielle Hypertonie (PAH) ist eine schwerwiegende Erkrankung mit hoher Morbiditäts- und Mortalitätsrate. Der Verlauf dieser Krankheit ist charakterisiert durch ein umfassendes pulmonalvaskuläres Remodeling, sowie einen damit verbundenen erhöhten pulmonalarteriellen Blutdruck, Gefäßwiderstand, und den Verlust kleinerer pulmonalarterieller Gefäße. Betroffen sind alle Schichten der Gefäßwand, jedoch nehmen pulmonalarterielle glatte Muskelzellen eine primäre Rolle in diesem Prozeß ein. Patienten, die an PAH leiden, zeigen oft eine Störung des SMAD-Signalwegs. In Patienten mit familiärer PAH ist häufig eine Mutation des assoziierten BMP-Rezeptors 2 (BMPR2) nachzuweisen. Zusätzlich konnten in Patienten mit pulmonalarterieller Hypertonie deutlich erhöhte Aktivitäten des "Platelet-derived-Growth-Factor"- (PDGF-) Signalwegs, sowie der Phosphodiesterase-5 (PDE5) gemessen werden. Der PDE5-Inhibitor Sildenafil ist bereits eine etablierte Medikation für pulmonalarterielle Hypertonie und sorgt durch eine erhöhte Akkumulation von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) für eine Vasodilatation und eine Reduktion der Zellproliferationsrate. Im Vergleich hierzu gilt der PDGF-Rezeptor-Inhibitor Imatinib als neuartige, experimentelle Behandlung, die in ersten Tests bereits vielversprechende Ergebnisse zeigte. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der molekularbiologischen, sowie physiologischen Auswirkungen der Kombinationsbehandlung dieser beiden Medikamente, insbesondere in Hinblick auf gemeinsame Auswirkungen auf den SMAD- ("MAD = Mothers against decapentaplegic gene; Sma = small body size protein) Signalweg, sowie die damit assoziierten Veränderungen in Zellzyklus, Proteinexpression, Proliferation und die damit verbundenen histologischen und physiologischen Veränderungen. Hauptobjekt dieser Arbeit waren pulmonalarterielle glatte Muskelzellen (PASMCs), da dieser Zelltyp eine zentrale Rolle in der Entwicklung einer PAH spielt. Mittels Thymidininkorporationsassay wurde durch eine Behandlung mit Sildenafil und Imatinib eine Reduktion der Zellproliferation nachgewiesen. Die Kombination beider Medikamente führte zu einem synergistischen Effekt auf diese Proliferationsreduktion. Anschließende Untersuchungen mit cGMP-Analoga zeigten, daß die Wirkung des Sildenafils auf die Zellproliferation durch die cGMP-abhängige Proteinkinase 1 (PKG) vermittelt wurde.Begleitet wurde diese Beobachtung durch eine Verringerung der Konzentration des Zellzyklusregulators Cyclin D1, was eine Unterbrechung des Zellzyklus bestätigt. Gleichzeitig lies die geringere Expression des Zellzyklusinhibitors p21 eine gleichzeitige Begünstigung der Apoptose der untersuchten Zellen vermuten. Untersuchungen der Proteinphosphorylierungen mittels Western Blot deckten auf, daß durch die Kombinationsbehandlung mit Sildenafil und Imatinib eine Zunahme der SMAD1/5/8-Aktivität stattfand, während die proliferations- und zellüberlebensfördernden Kinasen Proteinkinase B (AKT), extracellular-signal regulated Kinase (ERK) und Glykogen-Synthase-Kinase- (GSK-) 3& #946; durch die Kombinationsbehandlung inaktiviert wurden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, daß eine direkte Aktivierung mittels BMP4-Stimulation einen ähnlichen antiproliferativen Einfluß besitzt, wie eine Behandlung mit Sildenafil oder Imatinib. Das bedeutet, die verringerte Aktivität des SMAD-Signalwegs ist nicht nur ein Symtom von PAH, sondern im Umkehrschluß kann eine Aktivierung dieses Signalwegs auch den Krankheitsverlauf positiv beeinflussen. Die Untersuchungen an jungen Sprague-Dawley-Ratten deckten auf, daß vaskuläres Remodeling, welches 5 Wochen nach einmaliger Monocrotalin- (MCT-) Injektion durch histologische Präparation nachgewiesen wurde, verhindert werden konnte, indem die Tiere von Tag 21 bis Tag 35 nach der Injektion mit oral gegebenem Sildenafil und Imatinib (je 50mg/kg/d) behandelt wurden. Diese positiven Veränderungen gingen einher mit einer verstärkten Expression von BMPR2 und SMAD1/5/8 in den Gefäßwänden der mit Sildenafil und Imatinib behandelten Tiere, wobei eine Kombinationsbehandlung einen stärkeren Effekt zeigte als eine Behandlung mit Sildenafil oder Imatinib allein. In Begleitung hierzu bildeten so behandelte Tiere auch eine deutlich verringerte Rechtsherzhypertrophie aus und zeigten im Verhältnis zu MCT-behandelten Tieren einen signifikant verringerten rechtsventrikulären systolischen Druck und pulmonalvaskulären Widerstandsindex (PVRI), ohne daß der systemisch vaskuläre Widerstandsindex (SVRI) merklich beeinflusst wurde. Zusätzlich konnten in den Herzen dieser Tiere deutlich verringerte Zellteilungsraten durch Messung der Konzentration von Cyclin D1 mRNA und reduzierter Organstreß an Hand reduzierter Konzentration an schwere & #946;-Kette Myosin-mRNA (Myh7-mRNA), gesteigerter Konzentration an schwere & #945;-Kette Myosin-mRNA (Myh6-mRNA), sowie leicht verringerten Mengen der B-Typ natriuretischen Peptid-mRNA (BNP-mRNA) nachgewiesen werden. Diese Daten belegen, daß der SMAD-Signalweg im Krankheitsverlauf von PAH eine zentrale Rolle spielt und in Zukunft weitere Ansätze zu Behandlungsmöglichkeiten bietet. Obwohl noch viele Fragen zu klären sind, konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, daß dieser Signalweg durch Behandlung mit Sildenafil und Imatinib aktiviert wird und diese Aktivierung den molekularen und physiologischen Krankheitsverlauf auf vielfache Weise positiv beeinflusst. Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a severe disease with high morbidity and mortality. It is characterized by elevated pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular resistance due to extensive vasoconstriction, comprehensive vascular remodeling, as well as loss of small pulmonary vessels. Pulmonary vascular remodeling involves all layers of the vessel wall, but pulmonary arterial smooth muscle cells play a major role in this process. Patients suffering from idiopathic PAH, often show a disturbance of the SMAD signaling pathway, and in patients with familial PAH mutations of the BMP receptor 2 (BMPR2) have been described. In addition, it is well-known that upregulated platelet-derived growth factor - (PDGF) signaling and increased phosphodiesterase-5 (PDE5) are key pathological factors in PAH. The PDE5 inhibitor sildenafil is already an established medication for PAH and is proved to exhibit vasodilative and anti-proliferative effects by increasing levels of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). In comparison, the PDGF receptor inhibitor imatinib is considered as a novel treatment which has already shown promising results in initial preclinical and clinical studies. The aim of this study was to investigate the molecular and the physiological effects of the combination treatment of these two drugs, in particular in terms of common effects on SMAD (MAD = Mothers against decapentaplegic gene; Sma = small body size protein) signaling pathway, and the associated changes in cell cycle protein expression, proliferation, as well as the histological and physiological changes.This work employed pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs), since this cell type plays a central role in the development of PAH. Via Thymidin incorporation assay, a reduction in cell proliferation was detected by treatment with sildenafil and imatinib. The combination of both drugs resulted in a synergistic effect on this reduction. Subsequent studies with cGMP analogs showed that the effect of sildenafil on the inhibition of cell proliferation is delivered by cGMP-dependent protein kinase 1 (PKG). This observation was supported by a reduction in the concentration of the cell cycle regulator Cyclin D1, confirming disruption of the cell cycle. Additionally, the lower expression of the cell cycle inhibitor p21 suggests a increase in apoptosis of the cells investigated. Studies of protein phosphorylation by Western Blot revealed that the combination treatment with sildenafil and imatinib results in an increase of SMAD1/5/8 activity, while the proliferation and cell survival-promoting kinases protein kinase B (AKT), extracellular-signal regulated kinase (ERK) and glycogen synthase kinase- (GSK-) 3& #946; were inactivated by combination treatment. In addition, it was demonstrated that a direct activation of SMAD signaling pathway by BMP4 stimulation has a similar antiproliferative effect, such as treatment with sildenafil or imatinib. This means, that decreased activity of the SMAD signaling pathway is not only an aftereffect of PAH. The drug induced SMAD pathway activation also can affect the progression of this disease positively. Studies in the animal model with Sprague-Dawley rats revealed that pulmonary vascular remodeling, which has been examined 5 weeks after a single monocrotaline (MCT) injection, could be prevented by oral administered sildenafil and imatinib from day 21 to day 35 after MCT injection. These positive changes were accompanied by increased expression of BMPR2 and SMAD1/5/8 in the pulmonary vascular walls of sildenafil or imatinib treated animals, wherein a combination treatment showed stronger effects than treatment with sildenafil or imatinib alone. Besides the vascular changes, the treated MCT rats showed significantly reduced right heart hypertrophy, reduced right ventricular systolic pressure and pulmonary vascular resistance index (PVRI) whereas systemic vascular resistance index (SVRI) was not noticeably affected. Furthermore, reduced cell proliferation was indicated by decreased cyclin D1 mRNA Expression, and less organ stress in heart was suggested by decreased B-type natriuretic peptide (BNP) expression. These observations demonstrate that the SMAD signaling pathway plays a central role in the progression of PAH, which offers additional approaches for the treatment in the future. Although many questions still remain to be clarified, we could demonstrate that SMAD signaling pathway is positively influenced by the treatment with sildenafil and imatinib through diverse effects on the molecular and physiological levels.