Strukturelle und kinetische Charakterisierung der Nicotinsäuremononukleotid-Adenylyltransferase des Malariaparasiten Plasmodium falciparum

Abstract

Die Nicotinsäuremononukleotid-Adenylyltransferase (NaMNAT) ist ein Enzym mit einer für die NAD-Synthese essentiellen Funktion. In Erythrocyten, welche mit Malaria infiziert sind, wurden erhöhte NAD-Konzentrationen festgestellt. Daher sollte die NaMNAT von Plasmodium falciparum (PfNaMNAT) im Rahmen dieser Arbeit näher charakterisiert werden. Das Fundament dieser Arbeit stellen die beiden neuen Kristallstrukturen der PfNaMNAT dar, die jeweils mit 2,2 Å aufgelöst sind. Die Lösung der Struktur erfolgte über molekularen Ersatz mittels eines Homologiemodells der PfNamnat. Bei den Strukturen handelt es sich um Cokristallisationen, einmal mit dem ATP-Analogon APC, einmal mit dem Produkt Nicotinsäureadenindinukleotid (NaAD). Beide Strukturen ermöglichen es, sämtliche relevanten Interaktionen zwischen den beiden Substraten ATP und Nicotinsäuremononukleotid (NaMN) mit dem Enzym aufzuklären. Hierauf aufbauend kann gefolgert werden, dass es sich bei dem Reaktionsmechanismus um eine zufällige sequenzielle Bi-Bi-Reaktion handelt. Auch wenn die Sequenz der PfNaMNAT vergleichsweise stark von orthologen Enzymen abweicht, so zeigt die Struktur doch einen hohen Konservierungsgrad. Dies gilt insbesondere für das aktive Zentrum, mit einem konservierten Arginin und Tryptophan. Ausgehend von den homologen Strukturen einiger Bakterien kann darauf geschlossen werden, dass die PfNaMNAT durch die Substratbindung von einer offenen in eine geschlossene Konformation überwechselt (induced fit). Im Weiteren wurden mehrere funktionell relevante Cysteine identifiziert. Cys41 sowie Cys43 wurden anhand von Mutanten kinetisch charakterisiert. Bei Cys43 und Cys114 kann auf eine regulative Funktion geschlossen werden, für Cys41 ist eine katalytische Funktion belegt. In einer kinetischen Charakterisierung wurde zudem gezeigt, dass die PfNaMNAT NaMN gegenüber von Nicotinamidmononukleotid (NMN) moderat präferiert. Die bislang vermutete Anionenbindetasche für die Carboxylgruppe scheint dagegen nicht haltbar. Von O´Hara et al. wurde der Preiss-Handler-Weg als Quelle für die NAD-Synthese in P. falciparum postuliert. Anhand der hier gewonnenen Erkenntnisse scheint die Nutzung von NMN eine Alternative zu diesem Stoffwechselwege zu ermöglichen.Ein weiteres potentielles Wirkstoffziel stellt die Glutationreduktase von Plasmodium dar (PfGR). Im Rahmen eines in silico screening war das Molekül MPDI 21618 als Inhibitor der PfGR identifiziert worden. Daher wurde hier der Versuch unternommen den Wirkmechanismus über eine Cokristallisation von PfGR und MPDI 21618 aufzuklären.Darüber hinaus wurde erstmals ein für die Strukturaufklärung hinreichend streuungsfähiger Kristall von Plasmoredoxin (Plrx) erhalten. Auf dem Weg zur Bestimmung der Phaseninformation konnten hierbei erste Homologiemodelle erstellt werden, so dass es in Zukunft möglich sein wird, auch die Struktur dieses Proteins aufzuklären. Nicotinic acid mononucleotide adenylyltransferase (NaMNAT) is an enzyme possessing an essential functionality within NAD synthesis. Within human erythrocytes, infected with malaria, elevalted concentrations of NAD have been shown. Therefore NaMNAT of the malaria parasite Plasmodium falciparum (PfNaMNAT) has been characterized within this thesis. The foundation of this work is build up by the two novel 2.2 Å crystal structures of PfNaMNAT. Both of these structures contain ligands, one the ATP-analogue APC, the other one the product nicotinic acid adenine dinucleotide (NaAD). Both structures are complementary additions to one another and allow for the complete revelation of the interactions between both substrates ATP and nicotinic acid mononucleotide (NaMN) with the enzyme. Based upon this, it can be concluded, that the reaction mechanism is most likely a random sequential Bi-Bi-reaction. Substrates are arranged by PfNaMNAT in a perfect orientation, so that they can form a new bonding. Although the sequence of PfNaMNAT is only distantly related to other ortholog enzymes, the structure stills shows a remarkable degree of conservation. This is especially fulfilled for the actice site, containing a highly conserved arginine and tryptophane residue. Besides this, several conserved structural motives are to be found. Based upon the homologous structure of some bacteria it can be deduced, that PfNaMNAT changes from an open conformation into a closed one upon binding of the substrates, a so called induced fit. Besides several cysteine residues possessing functional relevance could be identified. Cys41 and Cys43 have been kinetically charactericed via their mutants. Cys43 as well as Cys114 a regulatory function can be postulated. For Cys41 a catalytically relevant function has been proven. Within kinetic characterization of the wildtype enzyme it could be shown, that PfNaMNAT prefers NaMN over nicotinamide mononucleotide (NMN) slightly. An up to now assumed anion binding pocket for the carboxylic acid of NaMN does not seem to be sustainable. The Preiss-Handler pathway has been proven as source for NAD synthesis in P. falciparum by O´Hara et al.. Considering the newly acquired results of this work, the direct utilization of NMN seems to represent an alternative to this pathway.Glutatione reductase of P. falciparum (PfGR) represents another attractive drug target. A virtual screening revealed the molecule MPDI 21618 as a potential inhibitor of PfGR. Within this study a cocrystallization of PfGR and MPDI 21618 was attempted to elucidate their interaction mode.In addition protein crystals of P. falciparum plasmoredoxin (Plrx), a 22 kDa redox-active protein have been obtained. A whole data set suitable for structure determination has been obtained. On the way to determine phase information first homology models have been generated, so that it should be possible to elucidate the structure of this protein in the near term future.