Functional characterization of the Trypanosoma brucei polyadenylation complex

Abstract

All protein-coding genes in the protozoan parasite Trypanosoma brucei are arranged in long clusters and are transcribed into polycistronic precursor RNAs. These pre-mRNAs require further processing by coupled trans splicing and polyadenylation to generate mature mRNAs. Although studies in the last decade have identified numerous spliceosomal components, we still know very little about the components, mechanisms, and dynamics of the 3´ end-processing machinery in trypanosomes. Moreover, most genes in trypanosomes contain one to three trans splice and even more dispersed polyadenylation sites, indicating that the regulation of both processes provides another, still not very well explored level of post-transcriptional gene regulation in trypanosomes: In terms of polyadenylation, factors regulating the polyadenylation efficiency of a primary transcript with a single poly(A) site directly affect protein expression, since unprocessed transcripts are degraded or not exported to the cytoplasm. In addition, multiple polyadenylation sites allow the generation of different transcript isoforms of a single gene by alternative polyadenylation.To characterize the catalytic core of the polyadenylation complex in T. brucei, we first identified the poly(A) polymerase [Tb927.7.3780] as the major functional, nuclear-localized enzyme in trypanosomes. In contrast, another poly(A) polymerase, encoded by an intron-containing gene [Tb927.3.3160], localizes mainly in the cytoplasm and appears not to be functional in general 3´ end processing of mRNAs. Based on tandem affinity purification with tagged CPSF160 and mass spectrometry, we identified ten associated components of the trypanosome polyadenylation complex, including homologues to all four CPSF subunits, Fip1, CstF50/64, and Symplekin, as well as two hypothetical proteins. RNAi-mediated knockdown revealed that most of these factors are essential for growth and required for both in vivo polyadenylation and trans splicing, arguing for a general coupling of these two mRNA-processing reactions.By combining genome-wide analysis of expression (RNA-seq) and in vivo RNA binding (iCLIP), we identified for the first time a trans-acting RNA-binding protein, the trypanosomatid polypyrimidine tract binding protein (PTB/hnRNP I) homolog DRBD4, as a regulator of polyadenylation. Based on SELEX-seq and iCLIP, we delineated purine-rich sequences containing AUGA elements as DRBD4 RNA-binding motif and mapped in vivo binding sites mainly in untranslated regions (UTRs). Integrating RNA-seq and iCLIP datasets revealed that DRBD4 binds upstream of poly(A) sites and modulates both their activation and repression, thereby affecting general transcript and isoform expression levels. Alle proteinkodierenden Gene des Parasiten Trypanosoma brucei, der zu den Protozoen zählt, sind in tandemartigen Clustern angeordnet und werden polycistronisch transkribiert. Die Prozessierung dieser Primärtranskripte in einzelne mRNAs erfordert eine gekoppelte trans- Spleiß- und Polyadenylierungsreaktion. Trotz der Identifizierung zahlreicher Faktoren des Spleißosomes in der letzten Dekade, ist nur wenig über die Faktoren, Mechanismen und Dynamik der Polyadenylierungsreaktion in Trypanosomen bekannt. Außerdem verfügen die meisten Gene über ein bis drei trans-Spleißstellen und stark degenerierte Polyadenylierungsstellen, wodurch sich eine weitere Ebene der posttranskriptionalen Genregulation ergibt, die jedoch weitgehend unerforscht ist: Eine Veränderung der Polyadenylierungseffizienz bei einem Transkript, das nur über eine Polyadenylierungsstelle verfügt, hat direkte Auswirkungen auf die Proteinexpression, da nicht prozessierte Transkripte degradiert oder nicht in das Cytoplasma exportiert werden. Außerdem ermöglichen mehrere Polyadenylierungsstellen die Herstellung von verschiedenen Transkriptisoformen eines einzelnen Genes durch alternative Polyadenylierung.Im Rahmen der Charakterisierung des T. brucei Polyadenylierungskomplexes haben wir zunächst die funktionelle, Zellkern-lokalisierte Poly(A) Polymerase [Tb927.7.3780] identifiziert. Die zweite Poly(A) Polymerase [Tb927.3.3160], die von einem Gen mit einem Intron kodiert wird, ist hingegen überwiegend cytoplasmatisch lokalisiert und nicht an der Polyadenylierung von mRNAs beteiligt. Mittels tandem affinity purification von Epitop-markiertem CPSF160 und einer anschließenden massenspektrometrischen Analyse konnten wir zehn Proteinfaktoren des Polyadenylierungskomplexes in T. brucei identifizieren: Homologe der vier CPSF Untereinheiten, Fip1, CstF50/64, Symplekin sowie zwei hypothetische Proteine. Des Weiteren konnten wir anhand eines RNAi-induzierten knockdowns der identifizierten Faktoren zeigen, dass die meisten sowohl für das Zellwachstum als auch für die in vivo Polyadenylierungs- und trans-Spleißreaktion essentiell sind.Durch die Kombination von genomweiten Genexpressions- (RNA-seq) und in vivo RNA-Bindungsdaten (iCLIP) konnten wir das RNA-Bindeprotein DRBD4, ein Homolog des humanen polypyrimidine tract binding proteins (PTB/hnRNP I), als ersten trans-aktiven Polyadenylierungsregulator in Trypanosomen identifizieren. Mittels SELEX-seq wurden Purin-reiche Sequenzen, die AUGA Tetramere enthalten, als Bindemotiv charakterisiert, und mittels iCLIP wurde die überwiegende Zahl der DRBD4 Bindungsstellen in untranslatierten Bereichen (UTR) von mRNAs lokalisiert. Anhand der kombinatorischen Auswertung der RNA-seq und iCLIP Datensätze konnten wir zeigen, dass DRBD4 upstream von Polyadenylierungsstellen bindet und sowohl für die Aktivierung als auch die Repression essenziell ist, wodurch generelle Transkript- und Isoformexpressionslevel reguliert werden.