Functional characterisation of ANKRD1 and its regulation by RASSF1A and YAP1 signalling

Abstract

The Hippo pathway controls organ size and is involved in both cell proliferation as well as in apoptosis. In cancer, the signalling via Hippo is deregulated and promotes tumor growth. The proto-oncogene YAP1 is the downstream transcriptional co-activator of this pathway with its function depending on the binding to several transcription factors such as TEAD, SMAD and TP73. The tumor suppressor gene RASSF1A is one of the main regulators of the Hippo signalling; however, RASSF1A is epigenetically silenced in cancer. In the literature, there are indications for the role of RASSF1A in the regulation of the pro-apoptotic function of the Hippo pathway. The aim of this study was to analyse the regulatory role of RASSF1A on YAP1 target genes. Therefore, a YAP1-inducible cell line was generated and further characterised after induction of YAP1 and co-expression with RASSF1A.An important observation in this study was the oncogenic potential of YAP1. The induction of YAP1 promotes cell proliferation by activation of pro-proliferative genes and by the transcriptional repression of tumor suppressor genes such as TP53, RASSF1A, BAX, CDKN1A and BBC3. Expression screenings by microarray revealed novel potential YAP1 target genes that are regulated by RASSF1A. In addition, microscopy and flow cytometry data showed that the expression of RASSF1A triggers the nuclear translocation of YAP1 inducing nuclear deformation, cell cycle arrest and apoptosis. In addition, it was observed that RASSF1A and YAP1 repress the expression of growth-associated genes and growth factors such as MDM2. Further analysis indicated that RASSF1A neutralizes the oncogenic function of YAP1 by activation of the YAP1 target genes ANKRD1, AJUBA, BAX and CDKN1A. RASSF1A activates Hippo signalling via the SARAH (Sav/Rassf/Hpo) domain and, together with YAP1, regulates the expression of the target gene ANKRD1. The further characterisation of ANKRD1 indicated its potential function as tumor suppressor gene. ANKRD1 inhibits cell growth and is silenced by promoter methylation in lung and in prostate cancer cell lines. At the protein level, ANKRD1 stabilises TP53 via reduction of the level of MDM2, which results in the transcriptional activation of CDKN1A and BAX. Previous reports suggested ANKRD1 as co- activator of TP53. In this study, the knockdown of ANKRD1 by siRNA and promoter assays corroborated the obtained findings and the data from the literature. The data from this work suggest a novel mechanism of RASSF1A and YAP1 interaction, namely to regulate TP53 and the G1/S cell cycle transition via the Hippo pathway and ANKRD1. The inactivation of RASSF1A by aberrant promoter methylation results in the deregulation of the signalling, which promotes cell proliferation by the action of the oncogene YAP1. Der Hippo Signalweg kontrolliert die Organgröße bei der Regulation der Zellproliferation und Apoptose. Bei Krebs ist der Hippo Signalweg dereguliert und fördert das Tumorwachstum. Das Proto-Onkogen YAP1 ist der transkriptionale Co-Aktivator dieses Signalwegs, und seine Funktion hängt von der Bindung an unterschiedliche Transkriptionsfaktoren wie TEAD, SMAD und TP73 ab. Das Tumorsuppressor-Gen RASSF1A ist einer der Hauptregulatoren des Hippo Signalwegs, jedoch ist RASSF1A in Krebszellen epigenetisch inaktiviert. In der Literatur gibt es Hinweise auf die Rolle von RASSF1A bei der Regulation der pro-apoptotischen Funktion des Hippo Signalwegs. Das Ziel dieser Arbeit war die Analyse der regulatorischen Rolle von RASSF1A auf die YAP1-Zielgene. Daher wurde eine YAP1-induzierbare Zelllinie generiert und charakterisiert sowohl nach der Induktion von YAP1 als auch nach Expression von RASSF1A.Eine wichtige Beobachtung dieser Studie war die potentielle onkogene Funktion von YAP1. Die Induktion von YAP1 fördert die Zellproliferation durch Aktivierung von pro-proliferativen Genen sowie durch die Transkriptionsrepression von Tumorsuppressor-Genen wie TP53, RASSF1A, BAX, CDKN1A und BBC3. Transkriptom-Analysen mittels Microarrays zeigten neue potentielle YAP1-Zielgene, die durch RASSF1A reguliert werden. Darüber hinaus zeigten Mikroskopie- und Durchflusszytometrie- Daten, dass die Expression von RASSF1A die nukleare Translokation von YAP1, Zellkernveränderung, Zellzyklus-Arrest und Apoptose induziert. Zusätzlich wurde beobachtet, dass RASSF1A und YAP1 die Expression von Wachstums-assoziierten Genen und Wachstumsfaktoren wie MDM2 unterdrücken. Weitere Analysen zeigten, dass RASSF1A die pro-proliferative Funktion von YAP1 durch Aktivierung der YAP1-Zielgene ANKRD1, AJUBA, BAX und CDKN1A neutralisiert. RASSF1A aktiviert den Hippo Signalweg über die SARAH-Domäne (Sav/Rassf/Hpo) und reguliert zusammen mit YAP1 die Expression des Zielgens ANKRD1. Die weitere Charakterisierung von ANKRD1 zeigte seine potentielle Funktion als Tumorsuppressor-Gen. ANKRD1 hemmt das Zellwachstum und ist durch Promoter-Methylierung in Lunge und in Prostatakrebs-Zelllinien inaktiviert. Auf Proteinebene stabilisiert ANKRD1 die Expression von TP53 durch Verringerung von MDM2, was zu einer transkriptionellen Aktivierung von CDKN1A und BAX führt. Die Literatur berichtet, dass ANKRD1 ein möglicher Co-Aktivator von TP53 sei. Die Ergebnisse dieser Studie bestätigten die erhaltenen Befunde und die Angaben aus der Literatur.Diese Ergebnisse deuten auf einen neuen Mechanismus von RASSF1A und YAP1 hin, um TP53 und den G1/S Zellzyklus-Übergang über den Hippo Signalweg und ANKRD1 zu regulieren. Die epigenetische Inaktivierung von RASSF1A führt zu der Deregulierung des Signalwegs, was widerum die Zellproliferation durch die Wirkung des Onkogens YAP1 fördert.