Entwicklung, Optimierung und Validierung von Analysenmethoden zur Bestimmung von Antibiotikarückständen in wässrigen und pflanzlichen Matrices mittels UHPLC-MS/MS

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Gesamtkreislauf der über Gülledüngung in landwirtschaftliche Nutzflächen eingetragenen Veterinärantibiotika betrachtet. Das Verhalten der Wirkstoffe während praxisnaher Güllevorbehandlungen, deren Persistenz und Verlagerungsverhalten in landwirtschaftlichen Nutzböden, deren Aufnahme aus dem Boden in Nutz- und Gemüsepflanzen (Deutsches Weidelgras, Möhren), sowie deren Infiltrationsverhalten mit dem Bodensickerwasser in Richtung Grundwasser wurden ausführlich untersucht. Hierzu wurden Aufwuchs- und Lysimeterstudien durchgeführt, sowie hessische Grundwässer im Rahmen eines Routinemessprogramms auf ihren Antibiotikagehalt analysiert. Für die Studien wurde sich auf so genannte Altwirkstoffe fokussiert, die im Zuge ihres Zulassungsverfahrens keiner ökotoxikologischen Bewertung unterzogen wurden.Eine Multimethode zum simultanen Nachweis ausgewählter Antibiotika aus der Wirkstoffgruppe der Tetracycline (Chlortetracyclin, Doxycyclin) und Sulfonamide (Sulfamethazin, Sulfamethoxazol) mittels Ultra-High-Performance-Liquid-Chlomatography-Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC/MS-MS) wurde für die Matrices Gülle, Weidelgras, Möhren und Wasser entwickelt, optimiert und validiert. Die Methode wurde zusätzlich um die Hauptmetabolite(N-Acetyl-Sulfamethazin, N-Acetyl-Sulfamethoxazol) und ein Transformationsprodukt (iso-Chlortetracyclin) erweitert. Die Richtigkeit der angewandten kombinierten Mess- und Aufarbeitungsmethode wurde durch die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen durch ein erfolgreiches Abschneiden (|z-Scores| < 2) bestätigt.Um erstmals die Belastung hessischer Grundwasserproben in Bezug auf die ausgewählten Antibiotika abschätzen zu können, wurden routinemäßig Grundwässer (~500 pro Jahr) im Auftrag des Hessischen Landesamtes für Naturschutz, Umwelt und Geologie (HLNUG) analysiert.Hierbei zeigte sich, dass ca. 4% der untersuchten Proben einen Antibiotikagehalt oberhalb der Bestimmungsgrenze von 50 ng L-1 enthielten, die maximale Konzentration betrug 1.703 ng L-1. Der Wirkstoff Sulfamethoxazol wurde am häufigsten gefunden.Über Lysimeterstudien wurde die Verlagerung der Wirkstoffe mit dem Bodensickerwasser untersucht, nachdem antibiotikahaltige, fermentierte Rindergülle einmalig unter praxisüblichen Mengen oberflächlich als Düngemittel auf den Boden aufgebracht wurde. Für die Studie wurden zwei typische Böden Nordhessens gewählt (Baunataler Löß, Volkmarser Sand). Die Bewässerung erfolgte an fünf Tagen pro Woche mit deionisiertem Wasser. In den wöchentlich aufgefangenen Bodeneluaten wurde als einziger Wirkstoff Sulfamethazin nachgewiesen. Die Verlagerungsfrachten über den zweijährigen Untersuchungszeitraum betrugen deutlich weniger als 1 % der aufgegebenen Wirkstoffmenge. Der Sandboden zeigte eine höhere Durchlässigkeit als der Lößboden. Um eine Aussage über den Verbleib der Antibiotika im Boden treffen zu können, wurde die Probenaufarbeitungsmethode für die Matrix Boden erweitert. Die Lysimeterböden wurden schichtweise in Abständen von 5 cm untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass die Tetracycline im Oberboden (0 5 cm) zurückgehalten werden.Die Durchführung der Carry-over-Studien erfolgte in Mitscherlichgefäßen fruchtangepasster Größe. Im ersten Aufwuchsjahr wurde Weidelgras auf den beiden Böden Baunataler Löß und Volkmarser Sand kultiviert. Die Antibiotikazufuhr erfolgte vor der Aussaat der Pflanzen über fermentierte Rindergülle in drei verschiedenen Konzentrationen. Als einziger Wirkstoff konnte Sulfamethazin in den oberirdisch geernteten Halmen des Weidelgrases nachgewiesen werden.Die Konzentrationen in der Pflanze stiegen mit der zur Verfügung stehenden Wirkstoffmenge im Gülle-Boden-Gemisch an. Pflanzen, die auf Sandboden kultiviert wurden, wiesen deutlich höhere Rückstandskonzentrationen an Sulfamethazin auf (bis 218 mikro g kgTM-1 im 100 mg kg-1-Ansatz) als vergleichbare Ansätze mit Lößboden (bis 48 mikro g kgTM-1 im 100 mg kg-1-Ansatz).Um das Aufnahme- und Verteilungsverhalten in Gemüsepflanzen zu untersuchen, wurden im zweiten Aufwuchsjahr Möhren als Saatpflanze ausgewählt. Als Versuchsboden wurde Volkmarser Sandboden verwendet. Der Antibiotikaeintrag erfolgte ebenfalls über dotierte Rindergülle. Diese wurde auf zwei verschiedene Arten vorbehandelt (8-tägige aerobe Lagerung, 40-tägige anaerobe Fermentation). Die Pflanzenkompartimente wurden einzeln untersucht. Tetracycline konnten lediglich in den Wurzeln und der Schale nachgewiesen werden, während Sulfonamide bis in die oberirdischen Pflanzenteile verlagert wurden. Die Verteilung der Wirkstoffkonzentrationen innerhalb der Pflanze ergab sich wie folgt: Wurzeln > Schale > Blätter > Rübe.Die Düngung mit fermentierter Gülle führte zu tendenziell höheren Wirkstoffrückständen in den Aufwuchspflanzen. Das Eliminierungsverhalten der Antibiotika im Zuge der Güllevorbehandlungen wurde ebenfalls untersucht. Hierzu wurden über den gesamten Lagerungs- und Fermentationszeitraum Gülleproben entnommen und analysiert. Hierbei zeigte sich eine Abnahme der Wirkstoffkonzentrationen in Abhängigkeit der Dauer, der Temperatur und des Sauerstoffgehaltes.Im Falle des (Epi)-Chlortetracyclins konnte die Bildung des (Epi)-iso-Chlortetracyclin beobachtet werden. Sulfamethoxazol zeigte die höchsten Eliminierungsraten. Die Substanz war nach der 40-tägigen Fermentation nicht mehr quantifizierbar.Zusammenfassend ist festzuhalten, dass ein komplexes Zusammenspiel aus Wirkstoffeigenschaften, Umwelteinflüssen, Bodenbeschaffenheit, Güllevorbehandlungsart, Pflanzenart und Pflanzenmorphologie das Verteilungs-, Aufnahme- und Akkumulationsverhalten ausgewählter Veterinärantibiotika in verschiedenen Umweltmedien bestimmen. In the present work the entire cycle of the fate and behavior of selected veterinary antibiotics entering the environment via liquid manure fertilization was investigated. The behavior of the active ingredients during practical liquid manure pretreatments, their persistence and displacement behavior in agricultural soils, their uptake from soil in agricultural crops and vegetable plants (perennial ryegrass, carrots), as well as their infiltration behavior with the soil interstitial water towards groundwater were comprehensively studied. For this purpose, growth and lysimeter studies were carried out, and Hessian groundwater was routinely analyzed for its antibiotic content. For all studies, the focus was placed on antimicrobials, which were not subjected to any ecotoxicological evaluation in the course of their admission procedure. A multi-method for the simultaneous determination of selected antibiotics from the antimicrobialgroup of tetracyclines (chlortetracycline, doxycycline) and sulfonamides (sulfamethazine, sulfamethoxazole) by means of ultra-high-performance-liquid-chomatography tandem mass spectrometry (UHPLC / MS-MS) was developed, optimized and validated for the matrices liquid manure, ryegrass, carrots and water. The method has been extended for relevant metabolites (N-acetyl-sulfamethazine, N-acetyl-sulfamethoxazole) and a transformation product (iso-chlortetracycline).The accuracy of the applied combined measurement and refurbishment method was confirmed by the successful participation in several proficiency tests (|z-scores| < 2).In order to estimate the contamination of Hessian groundwater samples with selected antibiotics, groundwater samples (~ 500 per year) were routinely analyzed. On behalf of the HLNUG, this was performed for the first time in Hesse. It was found that about 4 % of the examined samples contained an antibiotic content above the quantification limit of 50 ng L-1, the maximum concentration was 1,703 ng L-1. Sulfamethoxazole was detected most often.By means of lysimeter studies, the transfer of selected veterinary antibiotics with the soil leachate was investigated. Therefore antibiotic-containing, fermented cattle manure was superficially applied for one time to the soil as a fertilizer following good agricultural practice. For the studies two typical soils of North Hesse were chosen (Volkmarser sand, Baunataler loess). Irrigation was done five days a week with deionized water. Sulfamethazine was solely detected in the weekly collected soil eluates. The mass transfer over a two-year study was far below than 1 % of the added amount. The sandy soil showed a higher permeability than the loess soil. In order to be able to make a statement about the dislocation of the antibiotics in the soil, the sample preparation method was extended for the matrix "soil". The lysimeter soils were examined in defined layers. Tetracyclines were restrained in topsoil (0 5 cm).Carry-over studies were performed in Mitscherlich-vessels. In the first growing season ryegrass was cultivated on two different soils (Volkmarser sand, Baunataler loess). Antibiotics were added before sowing via fermented cattle manure in three different concentrations. Sulfamethazine could be detected in the above-ground blades of ryegrass. The concentrations in the plant increased with the added amount of antimicrobial in the slurry-soil mixture. Plants cultivated on sandy soil showed considerably higher residue concentrations of sulfamethazine (up to 218 micro g kgTM-1 in the 100 mg kg-1 batch) than comparable approaches with Loess soil (up to 48 micro g kgTM-1 in the 100 mg kg-1 batch).In order to investigate the uptake and distribution behavior of antibiotics in vegetables, carrots were selected as important plants in the second year of growth. As test soil Volkmarser sand was used. Again, the antibiotics were added via enriched cattle manure. The liquid manure was pretreated in two different ways (8-day aerobic storage, 40-day anaerobic fermentation). The plant compartments were individually examined. Tetracyclines could be detected only in the roots and the peel, while sulfonamides were transferred to the above-ground parts of the plant. The distribution of drug concentrations within the plant was as follows: roots & gt; peel & gt; leaves & gt; turnip. Fertilization with fermented liquid manure led to higher residual concentrations in the mature plants. The elimination behavior of the antibiotics in the course of liquid manure pretreatments was also investigated. For this purpose, liquid manure samples were taken and analyzed over the entire storage and fermentation period. The results showed a decrease in drug concentrations depending on duration, temperature and oxygen amount. In the case of (epi)-chlortetracycline, the formation of (epi)-iso-chlortetracycline was observed. Sulfamethoxazole showed the highest elimination rate. The substance was not quantifiable after 40 days of fermentation.In summary, it should be noted that a complex interaction of active ingredient properties, environmental influences, soil conditions, liquid manure pretreatments, plant species and plant morphology determines the distribution, uptake and accumulation behavior of selected veterinary antibiotics in various environmental media.