Etablierung eines funktionalen (Meta-)Genomansatzes zur Identifizierung von Klonen mit antibakterieller Aktivität

Abstract

Die Entwicklung von multiresistenten Bakterien als Auslöser von Infektionskrankheiten, die nicht mehr durch Antibiotika behandelbar sind, nimmt stetig zu. Eine weitere Problematik besteht darin, neue Antibiotika zu identifizieren wie zum Beispiel aus Bakterien, weil diese oft unter Standard-Laborbedingungen nicht kultivierbar sind und somit den klassischen Methoden zur Identifizierung von Wirkstoffen nicht zur Verfügung stehen. Daher sind neue Ansätze gefragt um dieses Problem zu lösen. Diese Forschungsarbeit setzt mit einem kombinierten Ansatz aus bioinformatischer Identifizierung von Biosynthese-Genclustern mit Bezug zu Antibiotika, aus sequenzierten bakteriellen Genomen sowie der Erstellung von Klonen als kulturunabhängige Methode an dieser Schlüsselstelle an. Zunächst wurden bioinformatisch, unerforschte Phyla in Bezug auf die Antibiotika-Forschung untersucht, um gezielter Stämme als Wirkstoffproduzenten zu identifizieren. Diese Analyse umfasste in der Summe 361 Stämme der Phyla Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi sowie des Superphylums Planctomycetes, Verrucomicrobia und Chlamydieae. Mit einem statistischen Ansatz wurden Stämme untersucht und festgestellt, dass 80 % aller Acidobakterien eine überdurchschnittliche Gencluster-Dichte aufweisen, von denen ein Großteil relevante Gencluster für eine potentielle Antibiotika-Biosynthese aufzeigen. Dieses Ergebnis wird durch die Identifizierung zahlreicher Resistenzgene unterstützt. Darauf aufbauend wurde das Acidobakterium Terracidiphilus sp. S55 für die Erstellung einer Klonbibliothek ausgewählt. Als zweiter Stamm dieses Phylums wurde Acidicapsa borealis untersucht. Das Genom wurde sequenziert-, durch eine Hybridassemblierung vollständig geschlossen und annotiert. Desweiteren wurden auch in diesem Stamm überdurchschnittlich vieleGencluster identifiziert. Die Etablierung eines kultur-unabhängigen Ansatzes umfasste die Gewinnung von Bakterien aus dem Termitennest von Coptotermis niger, welche zusätzlich taxonomisch klassifiziert wurden. Aus diesem metagenomischen Ansatz wurden 80 Klone für eine weiterführende Untersuchungen erstellt. In der Summe dieser Forschungsarbeit sind 960 Klone aus zwei unterschiedlichen Ressourcen weiter untersucht worden. Dies umfasste eine PCR-basierte Detektion von Adenyldomänen innerhalb des Gencluster-Typs für nicht-ribosomale Peptidsynthasen und zwei direkte Untersuchungsverfahren auf antibakerielle Aktivität. Dadurch konnten neun Klone mit antibakterieller Aktivität identifiziert werden, welche aus der genomischen DNS von Acidicapsa borealis stammen. Extrakte aktiver Klone wurden im weiteren Verlauf analytisch durch UHPLC-MS/MS untersucht, um Produkte zu identifizieren. Im Extrakt des Klons JF 7 C3 wurden die Tripeptide Valylprolylleucin und Isoleucylprolylisoleucin als heterolog exprimierte Produkte identifiziert. Die Etablierung dieses kultur-unabhängigen Ansatzes aus priorisierten Stämmen der Acidobakterien wurde in dieser Forschungsarbeit erfolgreich realisiert und stellt eine Grundlage für weitere funktionale (Meta-)Genomansätze zur Wirkstoffsuche dar. The rising number of multidrug-resistant bacteria causing untreatable infectious diseases is getting a serious issue. This problem is exacerbated due to the difficulty of discovering new antibiotics such as from bacteria. Thus, classical approaches relying on cultivation in natural product discovery are limited. This PhD-Thesis picks up this bottleneck due to a combined approach consisting of a bioinformatics-driven discovery for biosynthetic gene clusters regarding antibiotics and a protocol for preparing clone libraries as an culture-independent approach. In total, 361 underexplored strains concerning antibiotics research were taken into account. Those belong either to the bacterial phylum Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi or the superphylum Planctomycetes, Verrucomicrobia, Chlamydia (PVC ). It could be found out that 80 % of Acidobacteria have high gene cluster densities above the calculated average. In addition, several resistance genes of potentially relevant gene clusters for antibiotics biosynthesis could be identified. Thus Acidobacteria tend to be the most promising resource of this dataset. As a consequence, the strain Terracidiphilus sp. S55 and Acidicapsa borealis were chosed for clone library establishment. The latter was furthermore genome sequenced by using a hybrid assembly approach. Finally the genome was annotated and investigated according to outstanding traits. It could be found out that this strain also has an abnormal number of biosynthetic gene clusters compared to the dataset. In addition to that, a metagenomics-driven approach was established by gaining bacteria from the termite nest of Coptotermis niger, which were furthermore taxonomically classified. Subsequently 80 clones could be prepared from this sample. In sum 960 clones from two ressources were screened by means of a PCR-driven analysis for non-ribosomal peptide synthases and by direct antibiotics production, using a bioluminescence-based and an extract-based screening approach. Nine clones from Acidicapsa borealis DNA revealed antibiotic activity and were introduced to UHPLC-MS/MS analytics for compound detection. As a result, the two tripeptides Valylprolylleucin and Isoleucylprolylisoleucin, could be identified within the extract of clone JF 7 C3, as products of heterologous expression. In summary, this research project established methods to conduct functional (meta-)genomic experiments, which serves as basis and alternative approach to discover active natural products.