Regulation of carcinoma cell motility by the GTPase isoforms Rac1 and Rac1b

Abstract

The small Rho family GTPase Rac1 plays an important role in pre-metastatic events like cell scattering, migration and invasion in several tumor types. Alternative splicing leads to the generation of the splice variant Rac1b, which includes the alternative exon 3b and was characterized as a constitutive active Rac1 isoform. Previous work of our group and collaboration partners revealed antagonistic activities of Rac1 and Rac1b in transforming growth factor beta (TGFbeta)-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and tumor cell motility in pancreatic carcinoma cell lines. The studies of other groups have shown, that EMT is also fine-tuned by various splicing factors. Especially, the epithelial splicing regulatory proteins 1 (ESRP1) and 2 (ESRP2) were shown to regulate the alternative splicing of epithelialspecific proteins and were observed to be downregulated at the onset of EMT.In the course of this work, functional differences between the two GTPase isoforms Rac1 and Rac1b and their differential role in tumor cell invasion as well as EMT were analyzed. Initial experiments revealed substantial differences in Rac1b mRNA and protein amounts between various pancreatic and lung carcinoma cell lines, whereas Rac1 mRNA and proteins were expressed in comparable amounts. Subcellular fractionation and fluorescence microscopy analyses to determine the subcellular localization of Rac1 and Rac1b wildtype and mutant proteins revealed a predominantly membranous localization of wildtype Rac1b, which was comparable to constitutive active Rac1. In contrast, wildtype Rac1 showed a comparable cytoplasmic and membranous distribution. By applying the chorioallantoic membrane (CAM) model to study carcinoma cell invasion, a high heterogeneity in the invasive behaviors between all analyzed cell lines with different Rac1 and Rac1b protein expression levels was observed, indicating a more complex network of proteins and factors involved. Furthermore, CAM assays with H23 cell clones stably expressing EGFP-Rac1 and EGFP-Rac1b revealed an enhanced tumor cell scattering of invading H23/EGFP-Rac1 in comparison to H23/EGFP-Rac1b cells.Analysis of the mRNA and protein levels of different putative RAC1 splicing factors, both Rac1 isoforms and EMT-related factors revealed a relation in the mRNA and protein expression of Rac1b and ESRP1, a factor shown to be involved in exon 3b out-splicing, as well as ESRP2 and epithelial marker proteins. Furthermore, the siRNA-mediated depletion of Rac1b, ESRP1 and ESRP2 pointed toward a cooperation in the expression of ESRP2 and Rac1b. The TGFbeta1 stimulation of H358 lung carcinoma cells to induce EMT revealed a concomitant downregulation of Rac1b, ESRP1 and ESRP2 protein levels, thereby indicating a possible role of these factors in maintaining an epithelial phenotype. Die kleine GTPase Rac1 wurde in verschiedenen Tumorentitäten mit prä-metastatischen Ereignissen wie dem Zell-Scattering und einer erhöhten Tumorzellmigration sowie -invasion assoziiert. Durch alternatives Spleißen der RAC1 prä-mRNA wird Rac1b generiert, welches ein alternatives Exon 3b enthält und als konstitutiv aktive Rac1-Isoform charakterisiert wurde. Die bisherigen Studien der Arbeitsgruppe sowie ihrer Kollaborationspartner deckten antagonistische Aktivitäten von Rac1 und Rac1b in der transformierenden Wachstumsfaktor beta (TGFbeta)-induzierten epithelialen-zu-mesenchymalen Transition (EMT) und Tumorzellmotilität von Pankreaskarzinomzelllinien auf. Andere Gruppen zeigten auch eine wichtige Rolle verschiedener Spleißfaktoren in der Regulation der EMT auf. Dabei konnte eine Runterregulierung der epithelial-spezifischen Spleißfaktoren ESRP1 und ESPR2 in der frühen Phase der EMT beobachtet werden.Im Rahmen dieser Arbeit wurden funktionale Unterschiede zwischen den beiden RhoGTPase- Isoformen Rac1 und Rac1b sowie deren differentielle Rolle in der Tumorzellinvasion und EMT analysiert. Dabei wurden zunächst starke Unterschiede in der Menge an Rac1b mRNA und Proteinen zwischen den analysierten Pankreas- und Lungenkarzinomzelllinien festgestellt, wogegen Rac1 in vergleichbaren Mengen exprimiert wurde. Im Rahmen von Studien zur subzellulären Lokalisation mithilfe subzellulärer Fraktionierungs- und Fluoreszenzmikroskopischer Analysen konnte eine überwiegende Membranlokalisation von Rac1b festgestellt werden, welche mit der von konstitutiv-aktiven Rac1-Mutanten übereinstimmte. Wildtypisches Rac1 wies hingegen eine ausgeglichene cytosolische und membranöse Lokalisation auf. Das Chorionallantois-Membran (CAM)-Modells zur Untersuchung der Karzinomzellinvasion zeigte eine starke Heterogenität in dem invasiven Verhalten der analysierten Zelllinien mit unterschiedlichen Rac1- und Rac1b-Proteinexpressionsmusters auf. Dies spricht für ein komplexeres Netzwerk an beteiligten Faktoren. Die stabile Expression von EGFP-Rac1 in H23-Zellen führte zu einer erhöhten Zellstreuung der eingewanderten Zellen im CAM-Gewebe im Vergleich zu EGFP-Rac1b-expriemierenden H23-Zellen.Expressionsstudien zeigten eine Verbindung der Protein- und mRNA-Mengen von Rac1b mit der von ESRP1, einem bekannten Exon 3b Spleiß-Aktivator, sowie ESRP2 und einem epithelialen Expressionsmuster. Die siRNA-vermittelte-Depletion von Rac1b, ESRP1 und ESRP2 deckte eine mögliche Kooperation zwischen der Expression von Rac1b und ESRP2 auf. Zusätzlich führte die Induktion der EMT durch die TGFbeta1-Stimulation von H358-Zellen zu einer Reduzierung der Rac1b-, ESRP1- und ESRP2-Proteinmengen. Die Ergebnisse deuten auf eine mögliche Assoziation dieser Proteine mit einem epithelialen Phänotyp hin.