Characterization of peroxiredoxins and plasmoredoxin of the malarial parasite Plasmodium falciparum

Abstract

Malaria, one of the most severe infectious diseases, is caused by five pathogenic Plasmodium species: P. malariae, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei and P. falciparum. The latter, causing severe anaemia and cerebral malaria, accounts for the majority of malaria infections in Sub-Saharan Africa. The malarial parasite possesses two redox systems: the thioredoxin system and the glutathione system, both comprising a cascade of redox-active proteins. As P. falciparum lacks catalase and glutathione peroxidase, the parasite is in need of maintaining the intracellular redox balance which is provided by enzymes such as peroxiredoxins. Peroxiredoxins (Prxs) are thiol peroxidases involved in fundamental processes of life by providing antioxidant defense and by contributing to cellular redox regulation. Prxs are tightly regulated, occur in different oligomerization states, and reduce hydrogen peroxide, organic hydroperoxides, and peroxynitrite by thiol-based enzyme-substitution mechanisms. The unicellular eukaryotic malaria parasite Plasmodium falciparum possesses five Prxs including cytosolic Prx1a and Prx6, mitochondrial Prx1m, apicoplast Prx5, and nuclear PrxQ. Furthermore, the parasite imports human erythrocyte Prx2 into its cytosol to enhance its antioxidant capacity.In this thesis, the contributions of conserved amino acids located closely to the active site, at the dimer/dimer interface, or at the monomer/monomer interface to the catalytic cycle of Plasmodium peroxiredoxins were assessed. In-depth site directed mutagenesis studies on PfPrx1a indicated that the substitution of the conserved residue Tyr42 results in a complete loss of peroxidase activity, presumably because the mutated enzyme cannot form the catalytic essential higher oligomers anymore. Loss of Arg125 also led to a drastic decrease in activity, although the dynamic shift from decamer to dimer was intact. P. falciparum possesses a large repertoire of small redox-active proteins which have a thioredoxin sequence similarity and belong to the group of the thioredoxin superfamily. Plasmoredoxin (Plrx), has been identified by the Becker group and on the basis of databank information, Plrx seems to be unique for Plasmodium species. To continue, the accessibility of individual cysteine residues of PfPrxs and PfPlrx to S-glutathionylation and S-nitrosation, post-translational modification involved in regulation of protein structure and function, was studied. PfPrx1a, PfPrx1m, PfPrx5, PfPrxQ, and PfPlrx are identified as targets for post-translational modifications. For further in-depth analysis of the susceptible cysteine residues, cysteine mutants of PfPrx1a (C50S/C74A, C74A/C170S, C50S/C170S, C50S/C74A/C170S), PfPrx5 (C117S, C143S, C117S/C143S), and PfPrxQ (C56S, C103S, C56S/C103S) were glutathionylated. For PfPrx1a, all cysteines were found to be glutathionylated with particular susceptibility of Cys74 and Cys50. Both cysteines of PfPrx5 were glutathionylated, with a slight preference for Cys117 (CP of Prx5) over Cys143. For PfPrxQ, solely the peroxidatic cysteine Cys56 was found to bind glutathione. All wild type Prxs were analyzed for their glutathionylation sites via mass spectrometry. This method confirmed glutathionylation of all three cysteines in PfPrx1a, and both cysteines in PfPrx5. Although Western Blot analysis had indicated only Cys56 of PfPrxQ as target of glutathionylation, mass spectrometry (MS) showed that also the resolving cysteine Cys103 might be accessible. For PfPrx1m, MS indicated the peroxidatic (C152) and the resolving (C187) cysteine as glutathionylation sites.PfPlrx wild type enzyme and cysteine mutants PfPlrxC3S, PfPlrxC63S, and PfPlrxC115S were analyzed for their glutathionylation sites via mass spectrometry and the S-glutathionylation of the two active site cysteines C60 and C63 could be shown. Furthermore, PfPrxs and PfPlrx are accessible for S-nitrosation.This data provides further insight into the complex catalysis of these redox-active enzymes and points to potential novel target sites for specific enzyme inhibitors. Malaria, eine der schwersten Infektionskrankheiten, wird durch fünf pathogene Plasmodium-Arten verursacht: P. malariae, P. vivax, P. knowlesi, P. berghei und P. falciparum. Letzterer verursacht schwere Anämie und zerebrale Malaria und ist für die Mehrzahl der Malariainfektionen in Afrika südlich der Sahara verantwortlich. Der Malariaparasit besitzt zwei Redoxsysteme: das Thioredoxinsystem und das Glutathionsystem, die beide eine Kaskade von redoxaktiven Proteinen enthalten. Da es P. falciparum an Katalase und Glutathionperoxidase mangelt, muss der Parasit das intrazelluläre Redox-Gleichgewicht aufrechterhalten, das durch Enzyme wie Peroxiredoxine bereitgestellt wird. Peroxiredoxine (Prxs) sind Thiolperoxidasen, die an grundlegenden Lebensprozessen beteiligt sind, indem sie für die antioxidative Abwehr sorgen und zur zellulären Redoxregulation beitragen. Prxs sind streng reguliert, treten in verschiedenen Oligomerisierungszuständen auf und reduzieren Wasserstoffperoxid, organische Hydroperoxide und Peroxynitrit durch Thiol-basierte Enzym-Substitutionsmechanismen. Der einzellige eukaryotische Malariaparasit Plasmodium falciparum besitzt fünf Prxs, darunter zytosolisches Prx1a und Prx6, mitochondriales Prx1m, apikoplastisches Prx5 und nukleäres PrxQ. Darüber hinaus importiert der Parasit das humane Peroxiredoxin 2 (hPrx2) aus dem Erythrozyten in sein Zytosol, um seine antioxidative Kapazität zu erhöhen.In dieser Arbeit wurden die Beiträge konservierter Aminosäuren, die sich nahe am aktiven Zentrum, an der Dimer/Dimer-Grenzfläche oder an der Monomer/Monomer- Grenzfläche befinden, am katalytischen Zyklus von Peroxiredoxinen von P. falciparum untersucht. Eingehende ortsgerichtete Mutagenesestudien an PfPrx1a zeigten, dass die Substitution des Aminosäurerestes Tyr42 zu einem vollständigen Verlust der Peroxidaseaktivität führt, vermutlich weil das mutierte Enzym die katalytisch essentiellen höheren Oligomere nicht mehr bilden kann. Der Verlust von Arg125 führte ebenfalls zu einem drastischen Rückgang der Aktivität, obwohl die dynamische Verschiebung vom Decamer zum Dimer intakt war.P. falciparum besitzt ein großes Repertoire kleiner redox-aktiver Proteine, die aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeiten zu Gruppe der Thioredoxin-Superfamilie gehören. Plasmoredoxin (Plrx), wurde innerhalb der Arbeitsgruppe von Prof. Katja Becker identifiziert, und auf der Grundlage von Datenbankinformationen scheint Plrx einzigartig für Plasmodium-Arten zu sein. Es wurde zudem die Zugänglichkeit einzelner Cysteinreste von PfPrxs und PfPlrx für die S-Glutathionylierung und S-Nitrosierung, posttranslationale Modifikationen, die an der Regulation der Proteinstruktur und -funktion beteiligt sind, untersucht. PfPrx1a, PfPrx1m, PfPrx5, PfPrxQ und PfPlrx wurden als Ziele für post-translationale Modifikationen identifiziert. Zur weiteren eingehenden Analyse wurden die Cysteinmutanten von PfPrx1a (C50S/C74A, C74A/C170S, C50S/C170S, C50S/C74A/C170S), PfPrx5 (C117S, C143S, C117S/C143S) und PfPrxQ (C56S, C103S, C56S/C103S) glutathionyliert. Bei PfPrx1a waren alle Cysteine glutathionyliert, wobei eine besondere Anfälligkeit für Cys74 und Cys50 festgestellt wurde. Beide Cysteine von PfPrx5 waren glutathionyliert, mit einer leichten Präferenz für Cys117 (CP von Prx5) gegenüber Cys143. Bei PfPrxQ wurde nur das CP Cys56 als glutathionbindendes Cystein gefunden. Alle Wildtyp-Prxs wurden mittels Massenspektrometrie auf ihre Glutathionylierungsstellen analysiert. Diese Methode bestätigte die Glutathionylierung aller drei Cysteine in PfPrx1a und beider Cysteine in PfPrx5. Obwohl die Western-Blot-Analyse nur Cys56 von PfPrxQ als Ziel der Glutathionylierung angezeigt hatte, zeigte die Massenspektrometrie (MS), dass auch das CR Cys103 zugänglich sein könnte. Für PfPrx1m zeigte die MS das CP (C152) und das CR (C187) als Glutathionylierungsstellen an.Plasmoredoxin und die Cysteinmutanten PfPlrxC3S, PfPlrxC63S und PfPlrxC115S wurden mittels Massenspektrometrie auf ihre Glutathionylierungsstellen hin analysiert, und die S-Glutathionylierung der beiden Cysteine C60 und C63 an der aktiven Stelle konnte gezeigt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass PfPrxs und PfPlrx für die S-Nitrosierung zugänglich sind.Diese Daten geben weitere Einblicke in die komplexe Katalyse dieser redoxaktiven Enzyme und weisen auf mögliche neue Angriffspunkte für spezifische Enzyminhibitoren hin.