Design and application of circular RNAs for protein sponging and modulation of alternative splicing

Abstract

The presented work focuses on the design, production, and application of circular RNA (circRNA) for sequestration of RNA-binding protein hnRNP L and modulation of alternative splicing of CD45. For that, we first focused on circRNA expression systems and applied either tRNA-based, Tornado ribozyme-driven or in vitro intron type I-based circRNA expression systems, as well as in vitro-generated circRNAs. In addition, we developed several circRNA expression constructs based on the platelet-specific circRNA Plt-circR4.HnRNP L is a global regulator of alternative splicing, binding preferentially to CA-rich RNA sequences. Therefore, we designed and applied in HeLa cells circRNAs containing CA-rich sequences. Direct in vivo hnRNP L/circRNA interactions were captured by RNA immunoprecipitation (RIP) and alternative splicing of hnRNP L target genes was analyzed by RT-PCR. Interestingly, we observed hnRNP L delocalization from the predominant nuclear localization, which resulted in equal hnRNP L distribution between nucleus and cytoplasm in HeLa cells.As a part of the hnRNP L-regulated alternative splicing network, we targeted the gene coding for CD45, an essential regulator of T- and B-cell antigen receptor signaling. Therefore, we generated in vitro designer antisense circRNAs targeting splice sites, intron, or each of the three variable exons 4, 5, and 6 of the CD45 pre-mRNA as a proof of principle for developing designer antisense circRNAs that function in alternative splicing modulation. Consequently, we co-transfected a CD45 minigene construct together with the antisense circRNAs into HeLa cells and analyzed splicing patterns of CD45 minigene affected by antisense circRNAs. Specific splicing patterns were detected for each antisense circRNA variant applied, and these changes were determined to be at least partially of post-transcriptional nature.Overall, we conclude that designer circRNAs have high potential for modulating activities of RNA-binding proteins or for alterations of particular alternative splicing events. They represent a promising alternative to pharmacological inhibition of proteins and can be applied in a way similar to antisense splice-switching oligonucleotides targeting individual splicing events. Die hier vorgelegte Arbeit konzentriert sich auf das Design, die Produktion und die Anwendung von zirkulärer RNA (circRNA) zur Sequestrierung des RNA-Bindeproteins hnRNP L und zur Modulation des alternativen Spleißens von CD45. Zu diesem Zweck konzentrierten wir uns zunächst auf circRNA-Expressionssysteme und verwendeten entweder tRNA-basierte, Tornado Ribozym-gesteuerte oder in vitro Intron-Typ-I-basierte circRNA-Expressionssysteme sowie enzymatisch in vitro generierte circRNAs. Zusätzlich entwickelten wir mehrere circRNA-Expressionskonstrukte basierend auf der circRNA Plt- circR4.HnRNP L ist ein globaler Regulator des alternativen Spleißens, der bevorzugt an CA-reiche RNA-Sequenzen bindet. Daher designten und verwendeten wir circRNAs, die CA-reiche Sequenzen enthielten in HeLa Zellen. Direkte in vivo hnRNP L/circRNA-Wechselwirkungen wurden durch RNA-Immunpräzipitation (RIP) erfasst und alternatives Spleißen von hnRNP L-Zielgenen wurde durch RT-PCR analysiert. Interessanterweise konnte nach circRNA Transfektion in HeLa Zellen eine Delokalisierung von hnRNP L beobachtet werden, von einer vorwiegend nukleären Lokalisation hin zu einer gleichmäßigen Verteilung zwischen Kern und Zytoplasma.Zur Untersuchung des hnRNP L-regulierten alternativen Spleißnetzwerks fokussierten wir uns auf CD45, ein essentieller Regulator der T- und B-Zell Antigen-Rezeptor- Signalübertragung. Dafür wurden in vitro designer-antisense-circRNAs generiert, die gegen Spleißstellen, ein Intron oder eins der drei variablen Exons 4, 5 und 6 des CD45-Gens gerichtet sind. Dies dient als grundsätzliches Prinzip für den Einsatz von designer-antisense- circRNAs als Regulatoren des alternativen Spleißens. Zur Analyse der verschiedenen CD45- Spleißmuster wurde ein CD45-Minigen-Konstrukt zusammen mit den antisense-circRNAs in HeLa-Zellen co-transfiziert. Hierbei wurden spezifische Spleißmuster detektiert, die teilweise auf posttranskriptionelle Effekte zurückgeführt werden können.Zusammenfassend lässt sich sagen, dass designer-circRNAs das Potential zur Modulation der Aktivität von RNA-Bindungsproteinen sowie bestimmter alternativer Spleißereignisse haben. Sie stellen eine vielversprechende Alternative zur pharmakologischen Inhibition von Proteinen dar und können auf ähnliche Weise wie antisense-splice-switching-Oligonukleotide angewendet werden, die auf individuelle Spleißprozesse abzielen.