Deciphering cellular heterogeneity of cardiomyocytes and muscle stem cells during pathology and ageing

Abstract

Cellular heterogeneity is present on genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic and metabolomic levels. Single-cell approaches have revolutionized the detection of rare and subtle cellular subpopulations and are applicable to the majority of organs and tissues, including cardiac and skeletal muscles. Despite active research, many aspects of muscle heterogeneity remain unresolved. Examples for the latter, investigated in the current dissertation, are the evaluation of heterogeneity among cardiac muscle cells (CM) in basal vs. hypertrophic conditions, as well as juvenile vs. aged skeletal muscle stem cell (MuSCs) pool.In case of healthy adult cardiomyocytes wide ranging homogeneity was found with only minor transcriptional differences between cells of different nuclearity. When homeostasis was disturbed by traverse aortic constriction, which led to cardiac hypertrophy, a notable transcriptional heterogeneity among cardiomyocytes developed. Furthermore, cardiomyocytes located in poorly vascularized zones of the hypertrophic myocardium showed transcriptional signatures characteristic for hypoxic responses. In contrast to cardiomyocytes, strong cellular heterogeneity was found among quiescent MuSCs already at early age (2 month), which further changed with ageing (24 month). In particular, a subpopulation of quiescent MuSCs, defined by expression of the Gal gene, decreased, while a subpopulation expressing the Anxa3 gene emerged with age. Based on these findings, lack of Galanin and the induction of Annexin A3 were hypothesized to be of functional significance in the context of age- related reduction of muscle regeneration capacity. Systemic supplementation of Galanin peptide was applied to aged mice to restore juvenile levels of the neuropeptide. Intriguingly, application of Galanin partially rejuvenated the transcriptional profile of aged quiescent MuSCs. On the other hand, overexpression of Anxa3 gene in quiescent MuSCs abolished muscle regeneration and induced extensive muscle fibrosis in young mice, resembling conditions in aged muscles. Thus, Gal and Anxa3 are potential crucial factors, important for muscle regeneration in ageing animals.In conclusion, this work shows that cellular heterogeneity is not detectable among cardiomyocytes of different nuclearity, but appears when cardiomyocytes adapt to hypoxic conditions. Heterogeneity is, however, occurring in MuSCs upon ageing. The work presented in this thesis lays the groundwork to investigate whether the observed transcriptional and epigenetic heterogeneity is of functional relevance for organ homeostasis and pathological reactions in disease. Zelluläre Heterogenität existiert auf genomischer, epigenomischer, transkriptomischer, proteomischer und metabolomischer Ebene. Einzelzellansätze haben die Erkennung seltener zellulärer Subpopulationen revolutioniert und sind auf die meisten Organe und Gewebe anwendbar, einschließlich Herz- und Skelettmuskel. Trotz aktiver Forschung bleiben viele Aspekte der Muskelheterogenität ungelöst. Beispiele dafür sind die Bewertung der Heterogenität zwischen Herzmuskelzellen unter basalen und hypertrophen Bedingungen sowie der Pool von juvenilen und gealterten Muskelstammzellen. Die vorliegende Dissertation trägt zur Beantwortung dieser offenen Fragen bei.Im Rahmen der Arbeit wurde bei gesunden erwachsenen Kardiomyozyten eine weitreichende Homogenität mit nur geringen Transkriptionsunterschieden zwischen Zellen unterschiedlicher Nuklearität gefunden. In Reaktion auf eine durch Aortenverengung gestörte und zu Herzhypertrophie führenden Homöostase, entwickelte sich jedoch eine bemerkenswerte Transkriptionsheterogenität unter den Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigten Kardiomyozyten in schlecht vaskularisierten Zonen des hypertrophen Myokards Transkriptionssignaturen, die für hypoxische Reaktionen charakteristisch sind. Im Gegensatz zu Kardiomyozyten wurde bei ruhenden Muskelstammzellen bereits früh (2 Monate) eine starke zelluläre Heterogenität festgestellt, die mit zunehmendem Alter (24 Monate) weiter evolvierte. Insbesondere verkleinerte sich eine Subpopulation ruhender MuSCs, die sich durch die Expression des Gal-Gens auszeichnet, während eine andere, für die Expression des Anxa3-Gens kennzeichnend ist, mit zunehmendem Alter erst auftrat. Basierend auf diesen Befunden wurde angenommen, dass der Mangel an Galanin und die Induktion von Annexin A3 im Zusammenhang mit der altersbedingten Verringerung der Muskelregenerationskapazität von funktioneller Bedeutung sind. Um dies weiter zu erhärten wurde Galanin gealterten Mäusen systemisch als Protein verabreicht, mit dem Ziel sein Niveau die juvenilen Mäuse anzupassen. Interessanterweise verjüngte die Anwendung von Galanin das Transkriptionsprofil gealterter ruhender MuSCs teilweise. Im Gegensatz dazu interferierte eine Überexpression des Anxa3-Gens in ruhenden MuSCs mit der Muskelregeneration und induzierte in jungen Mäusen eine ausgedehnte Muskelfibrose, was dem Phänotyp gealterter Muskeln ähnelt. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Gal und Anxa3 für die Muskelregeneration bei alternden Tieren wichtig sind.Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass zelluläre Heterogenität bei Kardiomyozyten unterschiedlicher Nuklearität auf der Transkriptebene nicht nachweisbar ist, sich aber einstellt, wenn sich Kardiomyozyten an hypoxische Bedingungen anpassen. Heterogenität in MuSCs nimmt dagegen mit zunehmendem Alter zu. Die in dieser Dissertation vorgestellten Arbeiten bilden die Grundlage für weiterführende Studien, bezüglich der möglichen funktionellen Relevanz der beobachteten transkriptionellen und epigenetischen Heterogenität für die Organhomöostase generell, sowie im Kontext pathologischer Mechanismen.