BMP9 and BMP10 act directly on vascular smooth muscle cells for generation and maintenance of the contractile state

Abstract

Vascular smooth muscle cells (VSMCs) show a remarkable phenotypic plasticity reflecting their ability to acquire contractile or synthetic states. Numerous signaling pathways and conditions are known, which cause loss of contractility and attainment of a synthetic state but knowledge about signaling pathways promoting the contractile state is limited and in vivo evidence is critically missing. Here, we investigated the role of BMP9, BMP10, activin receptor-like kinase 1 (ALK1) and Smad7 for controlling formation of contractile VSMCs. Effects of Bmp9 and Bmp10 inactivation, conditional deletion of Alk1 in SMCs, overexpression of Bmp10 in endothelial cells (ECs) and overexpression of Smad7 in SMCs were evaluated in respect to coverage of vessels by VSMC, their contractile state and blood pressure. The molecular mechanisms underlying effects of BMP9/BMP10 were studied by treating dedifferentiated SMCs with BMP9/BMP10 in vitro. Concomitant genetic inactivation of BMP9/BMP10 in mice led to a dramatic diminution of VSMC layer, loss of contractile VSMCs and decreased systemic blood pressure. Consistently, overexpression of Bmp10 in ECs of adult mice dramatically enhanced VSMC contractility and increased formation of contractile VSMCs, indicating that BMP9/BMP10 play fundamental roles for differentiation and contractility of VSMCs. Importantly, treatment of BMP9/BMP10 induced an ALK1-dependent phenotypic switch from synthetic to contractile state in de-differentiated VSMCs. SMC-specific overexpression of inhibitory Smad7 completely suppressed differentiation and proliferation of VSMCs during embryonic development and reiterated the defects observed in BMP9/BMP10 double mutants in adults. Likewise, deletion of Alk1 in SMCs recapitulated attenuated VSMCs coverage and loss of contractile VSMCs seen in BMP9/BMP10 mutants but only in pulmonary and not in aortic or coronary arteries. Bulk RNA-seq and single molecule RNA-fluorescent in situ hybridization (RNA-FISH) uncovered heterogeneous expression of BMP type I receptors in distinct vessel beds, explaining phenotypic differences between Alk1 and Bmp9/Bmp10 inactivation. Furthermore, analysis of BMP9/BMP10 stimulated VSMCs by ATAC-seq combined with RNA-seq revealed that YAP/TEAD and BMP9/BMP10/Smad-signaling converge at promoters of several VSMC genes. Gain-and loss-of-function studies of the YAP-TEAD axis demonstrated that YAP-TEAD axis antagonized BMP9/BMP10 induced VSMCs differentiation and formation of contractile VSMCs.In conclusion, the study indicated that BMP9 and BMP10 are released into the blood stream by the liver and the right atrium, respectively and bypass the endothelial barrier to directly induce and maintain contractile VSMCs. Importantly, the effects of BMP9/BMP10 in VSMCs are modulated by different combination of BMP type one receptors in a vessel bed specific manner. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) verfügen über eine bemerkenswerte phänotypische Plastizität, die eine Umschaltung zwischen einem kontraktilen and einem synthetisch-proliferativen Zustand ermöglicht. Bis dato wurden zahlreiche Signalwege und Bedingungen beschrieben, welche den Übergang von VSMCs aus dem kontraktilen in den synthetischen Zustand fördern. Demgegenüber ist die Erkenntnis über Signalwege, die den kontraktilen Zustand induzieren sehr begrenzt und schlagende in-vivo Beweise fehlen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von BMP9, BMP10, Activin-Receptor-like Kinase 1 (ALK1) und Smad7 hinsichtlich der Bildung und Erhaltung kontraktiler VSMCs untersucht. Im Fokus stand dabei die glatte Muskelzellschicht von Blutgefäßen aus konditionalen BMP9/10 Doppel-Knockout (dKO) Mutanten, aus glatten Muskelzell-spezifischen ALK1-KO Mutanten sowie aus endothel-spezifischen BMP10- bzw. VSMC-spezifische SMAD7-Überexpressionsmutanten. Die Abdeckung verschiedener Gefäße mit VSCMs wurde untersucht, ebenso der Blutdruck in den verschiedenen mutanten Mausstämmen, sowie die Kontraktilität der VSMC. Des Weiteren wurden primäre, dedifferenzierte VSMCs ex-vivo mit BMP9 / BMP10 stimuliert, um einen Einblick in molekularen Mechanismen zu erlangen, die der Wirkung von BMP9/10 zugrunde liegen.Eine kombinierte genetische Inaktivierung von BMP9 und BMP10 bei Mäusen führte zu einer dramatischen Verringerung der VSMC-Schicht, einem Verlust kontraktiler VSMCs und einem verringerten systemischen Blutdruck. Im Einklang hiermit führte eine Endothel-spezifische BMP10 Überexpression zu einer verstärkten Bildung von VSMCs, die zudem eine erhöhte Kontraktiliät aufwiesen, was auf eine grundlegende Funktion der beiden Liganden bei der Regulation der VSMC Differenzierung hinweist. Zudem induzierte eine BMP9 / BMP10 Behandlung von de-differenzierten VSMCs einen ALK1-abhängigen phänotypischen Wechsel vom synthetischen in den kontraktilen Zustand. Die VSMC-spezifische Überexpression von inhibitorischem Smad7 blockierte die Differenzierung und Proliferation von VSMCs während der Embryonalentwicklung vollständig und rekapitulierte die bei BMP9 / BMP10-Doppelmutanten beobachteten Defekte im Erwachsenenstadium. Ebenso phänokopierte die Deletion von ALK1 in SMCs die abgeschwächte VSMCs-Abdeckung und den Verlust kontraktiler VSMCs in Lungen-, jedoch nicht in Aorten- oder Koronararterien. Bulk-RNA-seq und Einzelmolekül-RNA-FISH enthüllte eine heterogene Expression von BMP-Typ-I-Rezeptoren in verschiedenen Gefäßbetten, was die phänotypischen Unterschiede der Ausschaltung von BMP9/10 gegenüber einer Inaktivierung von ALK1 erklärt. Die Analyse von BMP9 / BMP10-stimulierten VSMCs durch ATAC-seq in Kombination mit RNA-seq zeigte, dass YAP / TEAD- und BMP9 / BMP10 / Smad-Signale an Promotoren mehrerer VSMC-Gene konvergieren. Funktionsgewinn- und Funktionsverluststudien deuten weiterhin darauf hin, dass die YAP-TEAD-Achse eine BMP9/BMP10 induzierte Differenzierung von VSMCs und die Bildung kontraktiler VSMCs antagonisierte.Zusammenfassend zeigt die Studie, dass im Blutstrom zirkulierendes BMP9 und BMP10 die Endothelbarriere umgehen, um den Eigenschaften kontraktiler VSMCs direkt zu induzieren und aufrechtzuerhalten. Die Wirkungen von BMP9/BMP10 in VSMCs werden durch unterschiedliche Kombinationen von BMP-Typ-1-Rezeptoren in einer Gefäßbett-spezifischen Weise moduliert.