Transkriptionelle Regulation des Wachstumsfaktors Gastrin beim kleinzelligen- und nichtkleinzelligen Bronchialkarzinom

Abstract

Die transkriptionelle Regulation der Expression von Gastrin in SCLC- und NSCLC-Zellen war bisher nicht untersucht worden. DieKlonierung der 5´-flankierenden Sequenzen des Gastringens und die Herstellung von Gastrinpromotor-Reportergenkonstrukten ermöglichteeine vergleichende funktionelle Untersuchung der Gastrinpromotor-Aktivität in der SCLC-Zellinie H69, der NSCLC-Zellinie 32M1 und derMesotheliom-Zellinie MSTO-211H. Die vorliegenden Untersuchungen konnten so eine zelltypspezifische Aktivität des Gastrinpromotors inLungentumorzellen nachweisen. In der MSTO-211H-Zellinie erwies sich der Gastrinpromotor als praktisch inaktiv. Für die NSCLC-ZellinieEPLC-32M1 und die SCLC-Zellinie H69 erwiesen sich drei Bereiche nahe des Haupttranskriptions-Startpunktes als relevantecis-regulatorische Regionen: eine negativ cis-regulatorische Sequenz um das CACCC-Element (Nt 106 bis Nt 102), eine positivcis-regulatorische Sequenz um das cRE-Element (Nt 148 bis Nt 119) und das gERE-Element (Nt 68 bis Nt 53).Dnase-Protektionsversuche zeigten im Sequenzbereich des CACCC- und des gERE-Elementes die in vitro Bindung von rekombinantemSp1 wie auch von nukleären Proteinen aus 32M1- und H69- Kernextrakten. Gelretardationsexperimente mit entsprechendenOligonukleotiden konnten die spezifische Bindung von Sp1- und Sp3- Proteinen an das cRE-, CACCC- und gERE-Element desGastrinpromotors nachweisen. Die Gelretardationsexperimente gaben darüber hinaus Hinweise auf mindestens einen weiteren bishernicht identifizierten Proteinfaktor, der in Lungentumorzellen an das CACCC-Element bindet, sowie auf zwei weitere Bindungsaktivitäten andas cRE- und gERE-Element, wobei es sich bei einem dieser beiden Faktoren möglicherweise um den bereits in GH4-Zellenbeschriebenen Transkriptionsfaktor (gERP1) handeln könnte. Transcriptional regulation of gastrin expression in SCLC- and NSCLC-cells has not been described yet. Recently, the 5´-flankingsequences of the gastrin gene were cloned. A comparative functional examination of gastrin promoter activity in the SCLC cell line H69, theNSCLC cell line 32M1 and the mesothelioma cell line MSTO-211H was possible by creating gastrin promoter-reporter gene constructs.The present study has identified a cell-specific activity of the gastrin promoter in lung cancer cells. However, in the MSTO-211H cell line onlya minimal gastrin promoter activity was detected. In the NSCLC cell line EPLC-32M1 and the SCLC cell line H69, three regions near themain trancription start site were identified as important cis-regulatory sequences: The negative cis-regulatory sequence around theCACCC element (Nt 106 bis Nt 102), the positive cis-regulatory sequence around the cRE element (Nt 148 bis Nt 119) and the gEREelement (Nt 68 bis Nt 53). DNase I protection experiments revealed in vitro the binding of recombinant Sp1 and nuclear proteins of32M1 and H69 cell extracts around the sequences of CACCC element and the gERE site. Electrophoretic mobility shift assays withcorresponding oligonucleotides demonstrated the specific binding of Sp1 and Sp3 proteins to the cRE, CACCC and gERE elements ofthe gastrin promoter. Additionally, the assays indicated the presence of at least another up to now not identified protein factor, that binds inlung cancer cells to the CACCC element and of two further binding activities to the cRE element and the gERE site, respectively. Possibly,one of these factors could be the transcription factor gERP1, which has already been identified in GH4 cells.