Darstellung apoptotischer und nekrotischer Rattenhepatozyten im Gewebeschnitt nach verschiedenen Fixierungsverfahren und mittels unterschiedlicher Nachweismethoden

Abstract

Die Nachweismethoden H& E-Färbung (Standard H& E- und alkoholische H& E-Färbung), Terminal DeoxynucleotidylTransferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL-Methode) und die Eosinfluoreszenz wurden zum Apoptosenachweis anRattenlebergewebe herangezogen. Hierfür wurde ein Apoptoseinduktionsmodell nach BURSCH et al. (1984; 1985; 1986) verwandt. DasGewebe wurde zwischen 1 und 92 Tagen rein in Formaldehyd, einen Tag in Formaldehyd fixiert und anschließend für die angegebene Zeitin Alkohol überführt oder in Carnoy fixiert. Zur Spezifitätskontrolle wurde ermittelt, inwieweit nekrotische Zellen oder andere unerwünschteStrukturen gleichfalls erfasst wurden. Standard H& E- und alkoholische H& E-Färbung: Um die geringsten Schwankungen der Werte auch bei archiviertem Nassmaterial zu erhalten, ist die Auswertung von Studien imStandard-Lichtmikroskop an Standard-H& E-Schnitten nach einer reinen Fixierung in Formaldehyd zu empfehlen. Sowohl bei derRoutinefixierung (1 Tag) als auch beim Einsatz an Archivmaterial wurden hierbei basierend auf morphologischen Kriterien die geringstenSchwankungen der Apoptose-Indizes erhalten. Bei den einen Tag Formaldehyd-fixierten und anschließend in Alkohol verbrachten Organenerwiesen sich die Daten als unzuverlässiger als nach reiner Formaldehyd-Fixierung. Die Carnoy-Fixierung in Kombination mit der0,4%igen alkoholischen H& E-Färbung hat bei standard-lichtmikroskopischer Auswertung das Ziel einer schnellen und si-cherenAuswertung nicht erreicht. Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End-Labeling (TUNEL) Im Vergleich zu der Standardmethode (Standard-H& E-Färbung) wurden mit der TUNEL-Methode höhere Apoptose-Indizes erhalten,allerdings mit einer breiteren Streuung der Daten. Mit einer Reduktion der Markierung bei längerer Fixierung und einer Reduktion derFärbeintensität, besteht beim Einsatz an Archivmaterial ein größerer Unsicherheitsfaktor als bei der Standard-H& E-Färbung. Es tratensehr starke nicht-hepatozelluläre TUNEL-positive Signale auf und nekrotische Zellen wurden zu 22%-40% ebenfalls markiert. Die zusätzlichnotwendige morphologische Kontrolle ließ somit keine unkritische Auswertung der positiven Signale zu und schränkt den Einsatz einesrechnergestützten Bildanalysegerätes erheblich ein. Wurden die Lebergewebeproben nach einem Tag in Formaldehyd-Fixierunganschließend in Alkohol aufbewahrt, wurden die höchsten AI erhalten, allerdings mit dem Nachteil breiterer 95%iger Vertrauensbereicheder Mittelwerte als bei reiner Formaldehyd-Fixierung und somit unzuverlässigerer Daten. EosinfluoreszenzBei der Fluoreszenz-Methode wiesen die Quotienten der Anstiegsfaktoren beider Dosisgruppen (der Anstiegsfaktor entspricht demAnstieg des AI von der Kontrolle auf den AI der jeweiligen Dosisgruppe) gegenüber der TUNEL-Methode weniger breite Streuungen aufund die AI entsprachen nach eintägiger Fixierung in etwa den Standard-H& E-Daten. Trotzdem kann der Einsatz derFluoreszenzmikroskopie an Archivmaterial nicht befürwortet werden, da bereits nach siebentägiger Fixierung die Apoptose-Indizeserheblich reduziert waren und nach vierwöchiger Fixierung die AI weiter reduziert wurden. Das Auffinden der AB nach einem Tag Fixierungwird anhand der Fluoreszenzmikroskopie allerdings erheblich erleichtert (STINCHCOMBE, 1996). Nekrotische Zellen wiesen ebenfallseine Fluoreszenz auf. Ebenso wurden fluoreszierende Strukturen (FS) ermittelt, die nicht der Apoptose zugeordnet werden konnten. Daeine morphologische Kontrolle aufgrund der schwachen Färbung (alkoholische H& E-Färbung) kaum möglich war, wird insbesondere derEinsatz der Fluoreszenz-Methode an Material, das länger als sieben Tage fixiert wurde, nicht empfohlen.

Detection of apoptotic cells and bodies in rat liver was determined by hematoxylin and eosin (H&E)-staining (standard and alcoholicH&E), terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL method), and eosin fluorescence. We used theapoptotic induction model of BURSCH et al. (1984; 1985; 1986). The tissue samples were fixed over various time periods between 1 and92 days. Three fixation methods were used: formaldehyde only, one day formaldehyde fixation followed by a 70% ethanol fixation, or fixationin carnoy solution. Necrotic cells or other positive structures which could be mistaken for apoptotic hepatocytes were counted as a controlfor specifity. Standard H&E- and alcoholic H&E-staining To avoid individual changes in the results, the use of standard light microscopy in combination with standard H&E-staining afterformaldehyde fixation only is recommended. Based on morphological characteristics, both, routine (one day) and long term (several weeks)fixation with 4% formaldehyde achieved the best apoptotic indices with the lowest variety. The data obtained after the fixation method withformaldehyde followed by ethanol are less reliable than after use of pure formaldehyde fixation. Carnoy fixation followed by alcoholic H&Estaining showed only very weak staining and was therefore not useful for rapid and specific determination of apoptotic rates by standardlight microscopy. Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) Compared to AI obtained by H&E staining andstandard light microscopy the AI measured with the TUNEL method were higher but also had bigger variations. With reduced amount ofTUNEL-positive apoptotic cells and bodies accompanied by reduced intensity of the staining the use of TUNEL staining for material fixedover longer time periods seems to result in less reliable data. Non-hepatocytes and 22%-40% of the necrotic cells were TUNEL positiveand showed intense staining. In conclusion, the TUNEL method in combination with an image processing and analysis system is only usefulin combination with morphologic control of positive signals. The highest AI were determined with fixation of the material in formaldehydefollowed by ethanol. The 95% confidence interval, however, was broader than after formaldehyde fixation only, thus the data less reliable. Eosin fluorescence Using the eosin fluorescence technique for estimating apoptotic indices yielded AI quotients (AI treated animals divided by AI of untreatedanimals) with lower standard deviations compared to the AI quotients calculated from the data obtained via TUNEL staining. After one dayof fixation the data obtained via the eosin fluorescence was similar to the data determined by using the H&E staining. However, our studyshowed that with the eosin fluorescence a reduction of AI is already happening after a fixation period of 7 days. After longer tissue fixationperiod the AI was reduced in higher values. Easy and fast recognition of apoptotic bodies with the fluorescence method after a short timefixation is still an advantage of this method (STINCHCOMBE, 1996). Necrotic cells showed fluorescence, too. Additionally, we foundfluorescing structures (FS) in the tissue that could not be related to an apoptotic event. A morphologic control with H&E is nearly impossiblebecause of the very weak tissue staining due to the alcoholic H&E staining method. In conclusion it leads to the recommendation to use thefluorescence technique only in tissue fixed for less than 7 days.