Entwicklung und Wirksamkeitsprüfung eines Impfstoffes zur aktiven Immunisierung gegen das Clostridium perfringens Alphatoxin

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte die Frage geklärt werden, ob die atoxischen gentechnisch hergestellten Alphatoxinvarianten (rAT) 121A/91und 121A/91-His212 die zur Immunisierung gegen das C. perfringens Alphatoxin Verwendung finden können. Das rAT121A/91 ist dasrekombinante Analog der atoxischen Alphatoxinvariante 121A/91, die vom natürlich vorkommenden C. perfringens Feldisolat 121A/91sezerniert wird. Die Variante 121A/91-His212 ist durch in vitro Mutagenese aus dem AT121A/91 hervorgegangen. Hierbei wurde dasArginin an Position 212, entsprechend der Wildtyptoxin-Sequenz, durch ein Histidin ersetzt. Studien mit den beiden rekombinantenVarianten und dem Alphatoxinspezifischen monoklonalen Antikörper 3B4 zeigten, daß die Alphatoxinvariante 121A/91- His212 einehöhere Bindungsaktivität gegenüber dem monoklonalen Antikörper aufweist als das rAT121A/91. Dies läßt darauf schließen, daß sich dasHis212 in einem für die Bindung essentiellen Aminosäurebereich befindet. Die beiden Alphatoxinvarianten ließen sich effektiv in E. coli pASK-IBA2-Expressionsvektoren exprimieren undaffinitätschromatographisch aus dem Periplasmaextrakt aufreinigen. Die Alphatoxinvarianten waren bei Immunisierungsversuchen in derMaus gut verträglich. Bei der Verwendung der Impfkandidaten in MF59, einem Öl in Wasser Adjuvans, traten bei der s.c. Immunisierungkeine und bei der i.p. Applikation nur geringgradige Allgemeinstörungen auf. Die s.c. Vakzinierung mit dem durch in vitro Mutagenesegewonnenen rAT121/91-His212 in Alu-Gel führte hingegen zu entzündlichen Veränderungen an der Applikationsstelle. Im ELISA konnte gezeigt werden, daß die i.p. Immunisierung mit beiden Varianten in MF59 zu Alphatoxin-spezifischen Antikörper Titernvon 1: 1.024.000 führte. Obwohl sich die Titer nicht in ihrer Höhe unterschieden, konnte im in vitro Hämolyse-Neutralisationsassaynachgwiesen werden, daß die mit dem rAT121A/91-His212 induzierten Antiseren eine stärkere antihämolytische Wirkung aufwiesen. Da die intraperitoneale Applikation auf die Anwendung im Mausmodell begrenzt ist, wurde das rAT121A/91-His212 zudem bei subcutanerImmunisierung getestet. In Kombination mit MF59 führte dies zu vierfach geringeren Antikörperkonzentrationen als nach intraperitonealerImmunisierung. Trotz niedrigerer Alphatoxin-erkennender Antikörpertiter war der Anteil antihämolysierender Antikörper jedoch um denFaktor zwei höher, als nach entsprechender i.p. Immunisierung. Die enzymatische Aktivität des Alphatoxins konnte mit beiden Seren in Kombination mit MF59 unabhängig vom Applikationswegneutralisiert werden. Die Seren, die mit Alu-Gel als Adjuvans bzw. ohne die Zugabe eines Adjuvans gewonnen worden waren, besaßenkeine PLC-inhibierende Wirkung. Im Toxinchallenge-Versuch war das rAT121A/91-His212 dem rAT121A/91 eindeutig überlegen. Bei der Verwendung vonrAT121A/91-His212 in Kombination mit MF59 überlebten bei i.p. Immunisierung bis zu 76% und bei s.c. Applikation bis zu 42% der Tieredie Belastung mit dem Wildtyptoxin. Bei den Tieren der Adjuvanskontrollen betrug die maximale Überlebensrate 17%. Die i.p.Immunisierung mit rAT121A/91 in MF59 führte hingegen nicht zu einer nachweisbaren Schutz der Tiere. Die im in vivo Belastungsversuch gewonnenen Ergebnisse wurden in einem in vitro Neutralisationsversuch bestätigt. Hierbei wurde mitAntiserum präinkubiertes Alphatoxin Mäusen intraperitoneal appliziert. Nur Tiere, denen ein Gemisch aus Alphatoxin mit durch i.p.Immunisierung von rAT121A/91-His212 in MF59 gewonnem Serum injiziert wurde, überlebten. Nach Vakzinierung von Mäusen mit dem durch in vitro Mutagenese gewonnenen rAT121A/91-His212 gelang es, Antiseren zu gewinnen,die sowohl die enzymatische Aktivität, als auch die hämolytische Wirkung des Alphatoxins neutralisierten. Die intraperitonealeVakzinierung mit der Alphatoxinvariante und einem Öl in Wasser Adjuvans war zudem geeignet, die letale Wirkung des Wildtyptoxinssowohl im in vitro Neutralisationsassay als auch im in vivo Belastungsversuch vollständig zu inhibieren bzw. signifikant zu reduzieren. DasrAT121A/91-His212 ist somit ein Impfantigen, das sich für eine aktive Immunisierung gegen das Alphatoxin von C. perfringens eignet. The goal of the present study was to determine the suitability of two non-toxic recombinant Clostridium perfringens alphatoxin variants(rAT), 121A/91 and 121A/91-His212, for use as potential vaccines. The rAT121A/91 is the recombinant analogue of the naturally occurring,non-toxic variant 121/91A. The 121A/91-His212 was constructed from 121/A91 using in vitro mutagenesis. The Arg at position 212 wassubstituted for a His residue to mimic the toxin sequence of the wild type toxic alphatoxin. Studies examining the binding of the alphatoxin-specific monoclonal antibody 3B4 indicated more mab 3B4 bound to the 121A/91-His212protein than the 121A/91 protein. This indicates that the His 212 residue is located in a region which is essential for mab 3B4 binding. Both variant alphatoxins could be effectively expressed using E. coli pASK-IBA2-expression vectors and were purified from the periplasmicextract. Immunisations with the alphatoxin variants were well tolerated by mice. Combined with the oil-in-water emulsion MF59, the IP immunisationresulted in a slight reaction measured by change in the condition of the mice and no change was seen with the SC immunisation. TherAT121A/91-His212 was also combined with aluminum gel and given by the SC route. This immunisation resulted in an inflammatoryreaction at the injection site. Sera from mice immunised IP with either of the variant alphatoxins in MF59 were tested in an ELISA and in an in vitro haemolysisneutralisation assay. This route of immunisation induced ELISA anti-alphatoxin titres of 1:1,024,000. Although the magnitude of the ELISAtitre was the same for both variants, the rAT121A/91-His212 variant induced anti-sera with higher anti-haemolytic activity. As the IPimmunisation is restricted to the mouse model, SC vaccination was also evaluated. Using this route with rAT121A/91-His212 and MF59resulted in four-fold lower ELISA titres than induced by the IP immunisation. However, the antihaemolytic activity of the sera induced by theSC immunisation were twice the magnitude of the IP immunisation. Sera from the immunised mice were also tested for the ability to inhibit the enzymatic cleavage of alphatoxin substrates. Sera from miceimmunised with either variant and MF59 were able to inhibit this reaction, however sera from aluminum gel adjuvanted vaccine groups ornon-adjuvanted groups did not inhibit PLC-hydrolysis. In toxin challenge assays the rAT121A/91-His212 was clearly superior to the rAT121A/91. When the animals were vaccinated using theMF59 adjuvant, survival rates for the rAT121A/91-His212 variant were 76% for the IP vaccinated group and 42% for the SC vaccinatedgroup. Immunisation with the rAT121A/91 variant in MF59 did not produce any enhancement of survival when compared to the adjuvantcontrols. In these studies the highest survival rate in the adjuvant controls was 17%. The results from the in vivo challenge studies were verified by an in vitro neutralisation assay. In this assay alphatoxin is pre-incubated withantiserum prior to injection into mice. The results of this study showed that only animals that were injected with alphatoxin, which had beenpre-incubated with anti-sera from rAT121A/91-His212 and MF59 immunised animals, survived. After the vaccination of mice with the construct rAT121A/91-His212, which was obtained through in vitro mutagenesis, anti-sera thatneutralised the enzymatic activity and the haemolytic activity of C. perfringens alphatoxin were induced. The intraperitoneal immunisationusing this construct and an oil-in-water adjuvant inhibited the lethal effects of the wild-type toxin in in vitro neutralisation assays andsignificantly reduced it in vivo challenge assays. This shows that the rAT121A/91-His212 variant can be used for the active immunisationagainst the alphatoxin of C. perfringens.