NETosis-derived effector mechanisms against Neospora caninum and new insights of seroprevalances in caprine and canine neosporosis

Abstract

Neosporosis is serious protozoan disease responsible of many reproductive disorders in ruminant industry. Productivity of sheep and goat is also seriously affected by infectious abortions, stillbirth and birth of weak kids with congenital neosporosis, impacting also small ruminant productive systems. Despite of this background, available investigations on importance of N. caninum infections on caprine populations worldwide are still scarce. Here we demonstrated for first time, novel data on seroprevalence and pathogenesis of N. caninum in goats from Costa Rica and Federal State Hesse (Germany) collecting current epidemiological information on this abortive apicomplexan parasite and analyzing their impact on caprine production in these two participating countries for their respective geographical areas [Central America (tropical climate) and Central Europe (template climate)]. Since the dog plays a crucial role in the reproductive cycle of N. caninum, additionally seroprevalence in a selected dog population in Germany was examined.The following relevant results were achieved:N. caninum infections were found in low-prevalence goats in both Germany (Hesse) (0.48%) and Costa Rica (7.9%). In Costa Rica, seropositive flocks with common pastures were associated with cattle and sheep. The data indicates a low vertical transmission rate. Preventive measures, such as the use of separate paddocks and the control of domestic and wild carnivores and their faeces on the pastures, will be essential for the future monitoring of caprine neosporosis. In a selected dog population in Germany, 7% seropositive animals were found, which could be confirmed by Western Blot. A wide knowledge on the role of early innate immune system against protozoan parasitoses is crucial to better understand molecular mechanisms involved in resulting host-parasite interactions and further cell-mediated adaptive immune responses, associated in the same way with clinical severity and outcome of this parasitic disease. Polymorphonuclear neutrophils (PMN) and other leukocytes (such as eosinophils, monocytes, and macrophages) are able to expel their DNA in a controlled process into extracellular environment and trapping pathogenic microorganisms by extruding neutrophil extracellular traps (NETs). These structures demonstrated to firmly attach, immobilize and entrap N. caninum tachyzoites, evidencing for the first time the importance of NETosis, as an additional effector mechanism in early host immune response during acute bovine and caprine neosporosis. Moreover, in both species, N. caninum-triggered NETosis illustrated a co-localization of DNA with antimicrobial molecules present in PMN nucleus and granules, such as histones (H1, H2A/H2B, H3, H4), neutrophil elastase (NE), myeloperoxidase (MPO), pentraxin (PTX) and cathepsins demonstrating classical nature of these extracellular defense structures. The main differences on NETs formation between these species were the short but thick size of caprine N. caninum-triggered NET structures; dose- and time-dependency was exclusively observed in bovine PMN whereas nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NOX)- and store-operated calcium entry (SOCE) independency were detected exclusively for caprine PMN. In general, obtained results have an important implication in the better understanding of complex pasarite-host interactions in vitro/in vivo during ruminant neosporosis, providing for the first time epidemiological information on the infection in goats from Germany and Costa Rica. Further more investigations on this topic are required, which might reduce initial infection rates during acute phase of neosporosis. Neosporose ist eine bedeutsame Protozoenerkrankung, die für viele Fortpflanzungsstörungen in der Wiederkäuerhaltung verantwortlich ist. Die Reproduktionsleistung von Schafen und Ziegen kann durch die Infektion mit N. caninum durch Aborte, Totgeburten und Geburten lebensschwacher Lämmern stark beeinträchtigt werden. Trotz dieser Bedeutung der Neosporose sind die verfügbaren Untersuchungen zu N. caninum-Infektionen in Ziegenpopulationen weltweit rar. Ziel der vorliegenden Studie war es daher Daten zur Seroprävalenz und Informationen zur Pathogenese von N. caninum bei Ziegen aus Costa Rica und dem Bundesland Hessen zu erhalten. Da der Hund im Vermehrungszyklus von N. caninum eine entscheidene Rolle spielt, wurde zusätzlich die Seroperavalenz in einer ausgewählten Hundepopulation in Deutschland untersucht. Folgende relevanten Ergebnisse wurden erzielt:N. caninum-Infektionen wurden bei Ziegen mit niedriger Prävalenz sowohl in Deutschland (Hessen) (0,48%) als auch in Costa Rica (7,9%) gefunden. In Costa Rica konnten seropositive Herden mit gemeinsamen Weidegang mit Rindern und Schafen in Verbindung gebracht werden. Die Daten deuten auf eine niedrige vertikale Übertragungsrate hin. Vorsorgemaßnahmen, wie z. B. die Verwendung von separaten Koppeln und die Kontrolle von heimischen und Wildfleischfressern und deren Fäkalien auf den Weiden, werden für die zukünftige Überwachung der Ziegenneosporose essentiell sein. In einer ausgewählten Hundepopulation in Deutschland wurden 7 % seropositive Tiere gefunden, die über Western Blot bestätigt werden konnten.Ein umfassendes Wissen über die Rolle des frühen angeborenen Immunsystems gegen die Protozoenparasitosen ist von entscheidender Bedeutung, um die Mechanismen der Wirt-Parasit-Interaktion und weiterer zellvermittelter adaptiver Immunantworten besser zu verstehen, die in gleicher Weise mit dem klinischen Schweregrad und den klinischen Ergebnissen assoziiert sind. Polymorphonukleare Neutrophilen (PMN) und andere Leukozyten (wie z. B. Eosinophilen, Monozyten und Makrophagen) sind in der Lage, ihre DNA in einem kontrollierten Prozess in die extrazelluläre Umgebung auszustossen und pathogene Mikroorganismen einzufangen, um sogenannte neutrophil extracellular traps (NETs) zu bilden. Diese Strukturen zeigten, dass viele N. caninum-Tachyzoiten fest angeheftet, immobilisiert und dann eingeschlossen waren, was zum ersten Mal die Bedeutsamkeit von NETosis als Effektormechanismus für die frühe Wirtsimmunantwort während einer Neospora-Infektion bei Rind und Ziege belegt. Darüber hinaus wies N. caninum-getriggerte NETosis in beiden Spezies eine Co-Lokalisierung von DNA mit antimikrobiellen Molekülen auf, die in den Neutrophilengranula vorhanden sind, wie Histone (H1, H2A / H2B, H3, H4), Neutrophile Elastase (NE), Myeloperoxidase (MPO), Pentraxin (PTX) und Cathepsine bezüglich der klassischen Natur dieses extrazellulären Abwehrmechanismus. Die Hauptunterschiede in der NET-Bildung zwischen diesen Tierarten waren die kurze, aber breite Form der caprinen N. caninum-ausgelösten NET-Strukturen; die Dosis- und Zeitabhängigkeit, die nur in den bovinen PMN beobachtet wurde, und die Unabhängigkeit von Nikotinamidadenindinucleotidphosphatoxydase (NOX) und speicherbetriebenen Calciumeintrittsmechanismen (SOCE), die ausschließlich in der Ziegen-PMN nachgewiesen wurden.Zusammenfassend tragen die vorliegenden Ergebnisse zum Verständnis der komplexen Wechselwirkungen zwischen Parasit und Wirt in vitro / in vivo im Verlauf der Wiederkäuer-Neosporose bei und geben erstmals epidemiologische Informationen über die Infektion bei Ziegen in Deutschland und Costa Rica.