Interaktionen zwischen Mastzellen und submukösen Neuronen unter Entzündungsbedingungen ex vivo und in vitro

Abstract

Die Rolle von Mastzellen bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (inflammatory bowel disease, IBD) wird kontrovers diskutiert. Einige Studien berichten über eine erhöhte Mastzelldichte bei IBD, wohingegen andere Studien eine Abnahme registrierten. Da Mastzellmediatoren dafür bekannt sind die intestinale Sekretion und Permeabilität zu erhöhen, stellte ich die Hypothese auf, dass eine Antigenantwort in sensibilisierten Tieren unter Entzündungsbedingungen ex vivo erhöht sein könnte, was zu der inadäquaten Immunantwort bei IBD beitragen würde.Daher wurde eine Gruppe von Ratten gegen Ovalbumin sensibilisiert und in einer zweiten Gruppe eine zusätzliche Kolitis mittels TNBS (2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure) induziert. In Ussing-Kammer-Experimenten wurden der Kurzschlussstrom (Isc), die Gewebeleitfähigkeit (Gt) sowie die parazelluläre Permeabilität von Segmenten des distalen Kolons (lokal entzündet) und Jejunums (nicht entzündet) gemessen. Parallel dazu wurden Mastzellmarker und Tight Junction Proteine mittels Immunfluoreszenz und qPCR bestimmt. Im Gegensatz zu der initialen Hypothese war der Antigen-induzierte Isc in Ussing-Kammer-Experimenten nicht erhöht, sondern zeigte eine tendenziell erniedrigte Anionensekretion im distalen Kolon und (wenn auch in geringerem Ausmaß) im Jejunum nach Kolitis-Induktion. Die Mastzelldichte war annähernd unverändert im distalen Kolon, wohingegen diese im Jejunum im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen um ca. 230 % nach Sensibilisierung anstieg. Nur im Jejunum führte der Antigenkontakt in der Ussing-Kammer zu einer erhöhten parazellulären Permeabilität im Gewebe sensibilisierter Tiere. Dieser Effekt blieb unbeeinflusst durch die zusätzliche Kolitis-Induktion. Die Expression der abdichtenden Tight Junction Proteine Claudin-3 und Claudin-4 auf Proteinebene war nach vorheriger Sensibilisierung in beiden Darmsegmenten signifikant erhöht; die zusätzliche Kolitis-Induktion führte zu einer Downregulation von Claudin-3. Aufgrund der erniedrigten Mastzell-vermittelten Isc-Antwort unter Entzündungsbedingungen untersuchte ich weiterhin, ob proinflammatorische Zytokine in vitro die Antwort des Darmepithels und der submukösen Neurone auf eine Mastzelldegranulation modulieren. TNFalpha sowie ein Zytokinmix (TNF alpha + IL-1 beta + IFN-gamma) bewirkten einen Anstieg des Isc und der Gt im distalen Kolon der Ratte. Die Mastzellaktivierung mittels Compound 48/80 blieb davon unberührt. Dahingegen war eine Stimulation der Ca2+-abhängigen Anionensekretion (durch Histamin oder Carbachol) signifikant erniedrigt, nachdem das Gewebe mit IL-1beta oder dem Zytokinmix vorbehandelt wurde. Ca2+-Imaging-Experimente zeigten eine erhöhte neuronale Aktivität nach 1-tägiger Inkubation einer Cokultur, bestehend aus submukösen Neuronen und einer Ratten-spezifischen Mastzelllinie (RBL-2H3), mit TNFalpha. Eine 3-tägige Inkubation der Cokultur mit dem Zytokinmix induzierte eine Apoptose in den RBL-2H3, wohingegen sich die Anzahl der Neurone, welche auf eine Mastzelldegranulation hin stimuliert wurden, signifikant erhöhte. Demzufolge könnte die Downregulation der epithelialen Sekretion durch eine erhöhte Sensitivität sekretomotorischer Neurone kompensiert werden, was zu einer konstanten epithelialen Sekretion nach Mastzellaktivierung führt. Zudem kann die Mastzellfunktion durch enterische Neurone moduliert werden, da die Stimulation nikotinerger Rezeptoren sowohl den Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration als auch den Isc-Anstieg nach Mastzellaktivierung durch Compound 48/80 hemmt. Diese Studie ist ein weiterer Beweis für die Anpassungsfähigkeit von Mastzellen und für die segmentabhängigen Unterschiede in den Mastzell-Epithel-Interaktionen unter Entzündungsbedingungen sowie für den starken Einfluss der enterischen Neurone, welche Immun- und Epithelfunktionen koordinieren. The role of mast cells in inflammatory bowel disease (IBD) is discussed controversially. While several studies report an increase of mast cell density during IBD, others found a decrease in it. As mast cell mediators are known to enhance intestinal secretion and permeability by affecting the epithelium directly and indirectly via activation of secretomotor neurons, I hypothesized that antigen exposure of sensitized animals might be elevated under inflammatory conditions ex vivo, which would contribute to the inadequate immune response during IBD. In these experiments, one group of rats was sensitized against ovalbumin, whereas in a second group a TNBS-colitis was induced additionally. In Ussing chamber experiments short-circuit current (Isc), tissue conductance (Gt) and paracellular permeability were measured in specimens of distal colon (inflamed) and jejunum (non-inflamed). In parallel, mast cell markers and tight junction proteins were determined with immunostaining and qPCR. In contrast to the initial hypothesis, the antigen evoked Isc in Ussing chamber experiments was not enhanced, but tended to be reduced in distal colon and to lesser extent in jejunum after induction of colitis. Mast cell density was unaltered in distal colon, whereas in jejunum the mast cells number increased by approximately 230 % after sensitization compared to that of untreated controls. Only in jejunum the antigen exposure evoked an increase of the paracellular permeability in segments of sensitized animals; this effect was unaffected by additional induction of colitis. Expression of the sealing tight junction proteins claudin-3 and claudin-4 on protein level was significantly elevated after sensitization in both intestinal segments; the additional induction of colitis evoked a downregulation of claudin-3.Due to the reduced Isc response induced by mast cell stimulation under inflammatory conditions, I investigated whether proinflamamtory cytokines change the response of the epithelium and submucosal neurons to mast cell degranulation in vitro. TNFalpha and a mix of proinflamamtory cytokines (TNFalpha + IL-1beta + IFN-gamma) caused an increase of Isc and Gt in rat distal colon. Mast cell stimulation with compound 48/80 was unaffected, whereas stimulation of Ca2+-dependent anion secretion (by histamine or carbachol) was diminished significantly after preincubation with IL-1beta and the cytokine mix. After 1 d TNFalpha exposure of a coculture consisting of submucosal neurons and a rat mast cell line (RBL-2H3), Ca2+ imaging experiments exhibited an enhanced neuronal activity. Prolonged exposure to the cytokine mix (3 d) induced apoptosis in RBL-2H3, whereas the number of neurons responding to mast cell degranulation increased significantly. Consequently, the downregulation of epithelial secretion might be compensated by an increased sensitivity of secretomotor neurons leading to a constant secretion after mast cell stimulation. Furthermore, mast cell function can be modified by enteric neurons as stimulation of nicotinic receptors inhibits the increase of cytosolic Ca2+ and the increase of the Isc after mast cell stimulation with compound 48/80.This study is a further evidence for the plasticity of mast cells and the segment-dependent differences in mast cell-epithelium interactions under inflammatory conditions. The study shows the strong impact of enteric neurons coordinating the immune and epithelial functions.