Warum zeigen die Herzglykoside Ouabain und Digoxin unterschiedliche Kreislaufwirkung? : Charakterisierung eines mutmaßlichen Herzglykosid-Bindungsproteins im Serum und Analyse der Wirkung beider Steroide auf die Endothelin-1 und NO-Freisetzung aus arteriellen Endothelzellen

Abstract

Die Bindung des hydrophoben Digoxin im therapeutisch wichtigen nanomolaren Konzentrationsbereich an den Herzglykosid-Rezeptor der Na+/K+-ATPase führt zu keiner Hemmung der Natrium-Pumpe aber zu einer Stärkung der Herzmuskelkontraktion. Auch langjährige Medikation mit Digoxin verändert den Blutdruck nicht. Wenn jedoch Ratten mit nanomolaren Konzentrationen des kürzlich als Nebennierenrinden-Hormon detektierten wasserlöslichen Ouabain (g-Strophanthin) behandelt werden, entwickeln sie einen arteriellen Hochdruck, der durch Digoxin-Therapie aufgehoben werden kann. Es erhebt sich daher die Frage, wieso das 'Stress-Hormon' Ouabain einen Bluthochdruck induzieren kann, nicht aber Digoxin, welches ebenfalls von der Nebenniere synthetisiert wird. Als möglicher Grund für die Wirkungsunterschiede bot sich die unterschiedliche Hydrophobizität beider Moleküle an. Diese könnte Auswirkungen auf den Transport im Blut haben. Es war auch denkbar, dass Affinitätsunterschiede in der Erkennung von Ouabain und Digoxin durch die Natrium-Pumpe intrazelluläre Signalketten in unterschiedlichem Maße aktivieren. Daher wurde in dieser Arbeit versuchtAls möglicher Grund für die Wirkungsunterschiede bot sich die unterschiedliche Hydrophobizität beider Moleküle an. Diese könnte Auswirkungen auf den Transport im Blut haben. Es war auch denkbar, dass Affinitätsunterschiede in der Erkennung von Ouabain und Digoxin durch die Natrium-Pumpe intrazelluläre Signalketten in unterschiedlichem Maße aktivieren. Daher wurde in dieser Arbeit versucht a. ein früher detektiertes Serumbindungsprotein für Herzglykoside zu charakterisieren und zu identifizieren; b. an menschlichen arteriellen Endothelzellen aus der Nabelschnur in Kultur zu erfahren, ob Ouabain und Digoxin unterschiedlich auf die Freisetzung des gefäßkontrahierenden Proteohormons Endothelin-1 bzw. des gefäßrelaxierenden Hormons NO wirken, und Vorstellungen über die Wirkungsweise zu erarbeiten. Die Untersuchungen ergaben:

Bei dem früher im Rinderserum entdeckten Bindungsprotein für Herzglykoside handelt es sich um die µ-Kette des IgM. Dies konnte mittels ELISA mit affinitätsgereinigten Antikörpern gegen das Protein, durch die Kreuzreaktivität mit authentischem Rinder-IgM und durch die Gewebeverteilung des Proteins sicher gestellt werden. Das hydrophobe Digoxin bindet wahrscheinlich unspezifisch an hydrophobe Oberflächenbereiche von Proteinen. Ouabain, nicht aber Digoxin, stimuliert in nanomolaren Konzentrationen sowohl die Freisetzung von Endothelin-1 aus menschlichen arteriellen Endothelzellen der Nabelschnur (HUAEC) in Kultur als auch die Aktivität der Natrium-Pumpe. Beide Herzglykoside stimulieren im nanomolaren Konzentrationsbereich die NO-Freisetzung. Die halb-maximale Hemmung der Natrium-Pumpe durch Ouabain erfolgt bei IC50 = 2 x 10-7 M, also in weit höheren Konzentrationen. Die herzglykosidbedingte Stimulierung der NO-Freisetzung wird nicht durch Hemmstoffe der src-Kinase (PP1, PP2), der Phospholipase C (U73122), von Gi-Proteinen (Pertussis-Toxin) oder der Phosphatidylinositol-3-kinase (Wortmannin) beeinflusst. Es finden keine Änderungen der zellulären cAMP und cGMP Konzentrationen statt. Ouabain und Digoxin erzeugen in HUAEC eine erhöhte Phosphorylierung von eNOS und akt/PKB. Die herzglykosidbedingte NO-Synthese wird aktiviert durch Hemmung der spannungsabhängigen L-Typ-Ca2+-Kanäle mit Verapamil und durch Hemmung des Na+/Ca2+-Austauschers durch Benzamil, Ni2+ und Co3+. Sie wird gehemmt durch die Blockade von 'Store-operated Ca2+-Kanälen' (SOC) mit Ly 294002. Aus den Untersuchungen wird geschlossen: Herzglykoside induzieren in nanomolaren Konzentrationen über eine direkte Interaktion der Natrium-Pumpe mit dem IP3-Rezeptor-Ca2+-Kanal des endoplasmatischen Reticulums eine Öffnung desselben und somit einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration. In der Folge wird durch die Eröffnung von SOC die intrazelluläre Ca2+-Konzentration weiter erhöht. Sie wird durch Hemmung des Na+/Ca2+-Austauschers, der durch Kopplung an die Na+/K+-ATPase wie eine Ca2+-Pumpe wirkt, erhöht. Die Stimulierung der Phosphorylierung von akt/PKB und eNOS erfolgt vermutlich über Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinasen. Dies führt zu einer vermehrten NO-Synthese und Freisetzung. Es wird vermutet, dass ein Anstieg des intrazellulären Ca2+ auch zu einer Stimulierung der Endothelin-Freisetzung und zur vermehrten Integration von Vesikeln mit latenten Natriumpumpen in die Plasmamembran führt. Diese Prozesse scheinen sich in ihrer Ca2+-Sensitivität zu unterscheiden.Die Unterschiede in der Herzglykosid-Spezifität von HUAEC in der Sekretion des gefäßkontrahierenden Endothelin-1 und des gefäßrelaxierenden NO könnten erklären, warum konstant erhöhte Ouabain-Blutspiegel einen arteriellen Bluthochdruck erzeugen können, nicht aber erhöhte Digoxin-Blutspiegel. a. ein früher detektiertes Serumbindungsprotein für Herzglykoside zu charakterisieren und zu identifizieren; b. an menschlichen arteriellen Endothelzellen aus der Nabelschnur in Kultur zu erfahren, ob Ouabain und Digoxin unterschiedlich auf die Freisetzung des gefäßkontrahierenden Proteohormons Endothelin-1 bzw. des gefäßrelaxierenden Hormons NO wirken, und Vorstellungen über die Wirkungsweise zu erarbeiten. Die Untersuchungen ergaben: Bei dem früher im Rinderserum entdeckten Bindungsprotein für Herzglykoside handelt es sich um die µ-Kette des IgM. Dies konnte mittels ELISA mit affinitätsgereinigten Antikörpern gegen das Protein, durch die Kreuzreaktivität mit authentischem Rinder-IgM und durch die Gewebeverteilung des Proteins sicher gestellt werden. Das hydrophobe Digoxin bindet wahrscheinlich unspezifisch an hydrophobe Oberflächenbereiche von Proteinen. Ouabain, nicht aber Digoxin, stimuliert in nanomolaren Konzentrationen sowohl die Freisetzung von Endothelin-1 aus menschlichen arteriellen Endothelzellen der Nabelschnur (HUAEC) in Kultur als auch die Aktivität der Natrium-Pumpe. Beide Herzglykoside stimulieren im nanomolaren Konzentrationsbereich die NO-Freisetzung. Die halb-maximale Hemmung der Natrium-Pumpe durch Ouabain erfolgt bei IC50 = 2 x 10-7 M, also in weit höheren Konzentrationen. Die herzglykosidbedingte Stimulierung der NO-Freisetzung wird nicht durch Hemmstoffe der src-Kinase (PP1, PP2), der Phospholipase C (U73122), von Gi-Proteinen (Pertussis-Toxin) oder der Phosphatidylinositol-3-kinase (Wortmannin) beeinflusst. Es finden keine Änderungen der zellulären cAMP und cGMP Konzentrationen statt. Ouabain und Digoxin erzeugen in HUAEC eine erhöhte Phosphorylierung von eNOS und akt/PKB. Die herzglykosidbedingte NO-Synthese wird aktiviert durch Hemmung der spannungsabhängigen L-Typ-Ca2+-Kanäle mit Verapamil und durch Hemmung des Na+/Ca2+-Austauschers durch Benzamil, Ni2+ und Co3+. Sie wird gehemmt durch die Blockade von 'Store-operated Ca2+-Kanälen' (SOC) mit Ly 294002. Aus den Untersuchungen wird geschlossen:Herzglykoside induzieren in nanomolaren Konzentrationen über eine direkte Interaktion der Natrium-Pumpe mit dem IP3-Rezeptor-Ca2+-Kanal des endoplasmatischen Reticulums eine Öffnung desselben und somit einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration. In der Folge wird durch die Eröffnung von SOC die intrazelluläre Ca2+-Konzentration weiter erhöht. Sie wird durch Hemmung des Na+/Ca2+-Austauschers, der durch Kopplung an die Na+/K+-ATPase wie eine Ca2+-Pumpe wirkt, erhöht. Die Stimulierung der Phosphorylierung von akt/PKB und eNOS erfolgt vermutlich über Ca2+-Calmodulin abhängige Proteinkinasen. Dies führt zu einer vermehrten NO-Synthese und Freisetzung. Es wird vermutet, dass ein Anstieg des intrazellulären Ca2+ auch zu einer Stimulierung der Endothelin-Freisetzung und zur vermehrten Integration von Vesikeln mit latenten Natriumpumpen in die Plasmamembran führt. Diese Prozesse scheinen sich in ihrer Ca2+-Sensitivität zu unterscheiden. Die Unterschiede in der Herzglykosid-Spezifität von HUAEC in der Sekretion des gefäßkontrahierenden Endothelin-1 und des gefäßrelaxierenden NO könnten erklären, warum konstant erhöhte Ouabain-Blutspiegel einen arteriellen Bluthochdruck erzeugen können, nicht aber erhöhte Digoxin-Blutspiegel.

Binding of the hydrophobic cardiac glycoside digoxin in therapeutically relevant nanomolar concentrations to Na+/K+-ATPase does not lead to an inhibition of the sodium pump, but increases muscular contractility of the heart. Medication with digoxin even for many years does not change blood pressure. If, however, rats are treated with nanomolar concentrations of the water soluble cardiac glycoside ouabain, which was recently described to be a hormone synthesized by the adrenal gland, this treatment leads to hypertension. Hypertension induced by Ouabain can be lowered by digoxin therapy. These different findings lead to the question, why the stress hormone ouabain may induce hypertension, whereas digoxin, which is likewise synthesized by the adrenal gland, does not. As a possible reason for these effects, the different hydrophobicities of both molecules must be considered. These could have effects on the transport mechanisms in blood. It is also conceivable that differences in the sodium pump affinity of ouabain and digoxin lead to different intracellular signaling pathways. The aim of this work was

to characterize and identify a binding protein for cardiac glycosides which had been detected before, to investigate whether ouabain and digoxin have different effects on the release of the vasoconstrictive hormone endothelin-1 and the vasodilative NO in human umbilical cord artery endothelial cells (HUAEC) The following results were achieved: The binding protein for cardiac glycosides, which had been discovered in bovine serum, is the µ-chain of IgM. This could be shown by an ELISA with affinity-purified anti-bodies against the protein, by crossreactivity of these anti-bodies with IgM and by measurement of the tissue distribution of the protein. It seems that the hydrophobic digoxin binds non-specifically to hydrophobic protein surfaces. Ouabain, unlike digoxin, stimulates in nanomolar concentrations both the release of endothelin-1 from HUAEC and the activity of the sodium pump. Either of the investigated cardiac glycosides stimulate NO release in nanomolar concentrations. The IC 50 (inhibitory concentration, 50%) of ouabain for sodium pump inhibition is 2 x 10-7 M, indicating that these effects were not results of pump inhibition. The cardiac glycoside-induced stimulation of NO-release is not inhibited by blocking of src-kinase by PP1 and PP2, of phospholipase C by U73122, of Gi-proteins by pertussis toxin or of phosphatidylinositol-3-kinase by wortmannin. It is inhibited by blocking of store operated Ca2+-channels (SOC) by Ly294002. No changes in cAMP and cGMP concentrations take place under the influence of either of the substances. Ouabain and digoxin increase phosphorylation of eNOS and akt/PKB in HUAEC. Cardiac glycoside-induced NO synthesis is activated by inhibition of the voltage-dependent L-type-Ca2+-channels by verapamil and by inhibition of the Na+/Ca2+-exchanger by benzamile, Ni2+ and Co3+. These results indicate that: Nanomolar concentrations of cardiac glycosides induce opening of the IP3-receptor-Ca2+-channel of the endoplasmatic reticulum via direct interaction with the sodium pump and thus a rise of the intracellular calcium concentration. This leads to an opening of SOC. Intracellular Ca2+ rises further. This effect is enhanced by inhibition of the Na+/Ca2+-exchanger, which acts physiogically like a Ca2+-pump. Stimulation of phosphorylation of akt/PKB and eNOS is probably achieved by the calcium-calmodulin dependent protein kinases. These phosphorylations lead to an elevated NO synthesis and release. It is assumed that a rise of intracellular Ca2+ also leads to an increased endothelin-1 release and integration of vesicles with latent sodium pumps into the plasma membrane. These processes seem to vary in their Ca2+-sensitivity. The different effects of cardiac glycosides on HUAEC with respect to secretion of endothelin-1 and NO could explain, why constantly increased ouabain levels in blood lead to hypertension, whereas elevated digoxin levels do not.