Immunhistochemische Analyse der Leptin-induzierten Transkriptionsfaktoren STAT3 und STAT5 im Gehirn der Ratte

Abstract

Leptin greift in die Regulation der Nahrungsaufnahme und der Energie-Homöostase sowie bei der Modulation vieler anderer neuroendokriner Mechanismen hauptsächlich über den Hypothalamus ein. Hier werden Leptin-induzierte Effekte über den JAK-STAT-Signalweg, besonders über eine Aktivierung des STAT3-Transkriptionsfaktors, vermittelt. In vielen peripheren Geweben ist Leptin ebenfalls in der Lage, eine nukleäre STAT5-Translokation auszulösen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte untersucht werden, welche Strukturen im Gehirn der Ratte, besonders in hypothalamischen Kerngebieten, eine Leptin-Wirkung über den JAK-STAT-Signalweg vermitteln. Ausschlaggebend für eine Kartierung funktioneller Leptin-Zielstrukturen ist die Detektion einer nukleären STAT-Translokation in Zellen des Gehirns. Zu diesem Zweck wurden Studien an zwei in vivo-Modellen an Ratten durchgeführt. Zum einen wurde Leptin zentral (i.c.v., 3,5µg/Tier) zur Detektion von Leptin-induzierten nukleären STAT5-Faktoren und zum anderen systemisch (i.p., 5mg/kg KM) zur Detektion von Leptin-induzierten nukleären STAT3- bzw. STAT5-Faktoren appliziert. Die Detektion dieser nukleären STAT3- bzw. STAT5-Signale erfolgte mittels immunhistochemischen Analyse-Verfahren. Die Phänotypen Leptin-responsiver Zellen im Gehirn der Ratte wurden zusätzlich bestimmt. Durch Kolokalisationsstudien mittels einer Detektion der STAT3- bzw. STAT5-Faktoren und der DAPI-Kernfärbung konnte ein eindeutiger nukleärer Ursprung der Signale nachgewiesen werden. Unter dem Einsatz von zellspezifischen Marker-Proteinen (NeuN für Neurone, vW-Faktor für Endothelzellen und GFAP für Astrozyten) konnten dann die nukleären STAT3- bzw. STAT5-Signale bestimmten Zellphänotypen zugeordnet werden. Nach systemischer Leptingabe traten nukleäre STAT3-Signale am intensivsten und häufigsten zum Zeitpunkt 90min post injectionem auf. Sie waren im caudobasalen Hypothalamus vor allem im Nucleus arcuatus (ARC, medialer und lateraler Subkern), Nucleus hypothalamicus ventromedialis (VMH, dorsomedialer Subkern), Nucleus hypothalamicus dorsomedialis (DMH, ventraler Subkern), Nucleus praemamillaris ventralis (PMV), in der Area retrochiasmatica (RCH) und der Area periarcuata (PAA) vertreten. Außerhalb des Hypothalamus konnten Leptin-induzierte nukleäre STAT3-Signale sowohl in dem im Hirnstamm lokalisierten Nucleus tractus solitarius (Sol) als auch in Blutgefäßen im gesamten Gehirn und im Plexus choroideus (PC) beider Vl detektiert werden. Mittels der Kolokalisationsstudien konnte zum ersten Mal die Leptin-induzierte nukleäre STAT3-Translokation klar in Neuronen, Endothelzellen und Zellen des PC nachgewiesen werden. Somit spielen außer Neurone auch andere nicht-neuronale Zellphänotypen eine funktionelle Rolle bei der Signalübermittlung des Fettgewebehormons Leptin. Ebenfalls erstmals konnte gezeigt werden, dass Leptin neben einer Aktivierung von STAT3 im Hypothalamus auch eine nukleäre STAT5-Translokation induzieren kann. Das Antwortverhalten auf die Leptingabe hin fiel jedoch von Einzeltier zu Einzeltier sehr heterogen aus. So fiel auf, dass nach zentraler Gabe, außer im Nucleus supraopticus (SO), kaum ein Unterschied zwischen Leptin-stimulierten und NaCl-behandelten Tieren nachzuweisen war. 30min nach der Stimulation traten geringfügig mehr Leptin-induzierte nukleäre STAT5-Signale im hypothalamischen Nucleus paraventricularis (PaV), Nucleus periventricularis (Pe), PMV und im Nucleus praeopticus magnocellularis (MCPO) als bei den Kontrolltieren auf. Im Gegensatz dazu waren nach der systemischen Stimulation mit Leptin 120min post injectionem (in der RCH und in Ependymzellen des VIII nach 150min) die Dichte und Intensität der induzierten nukleären STAT5-Signale deutlich stärker als bei den Kontrolltieren. Hier reagierten besonders der ARC (nicht nur der mediale und laterale, sondern auch in geringem Umfang der dorsale Subkern), PMV, SO, TM, und die RCH mit einer Leptin-induzierten nukleären STAT5-Translokation. Kolokalisationsstudien mit NeuN und anschließender quantitativer Bestimmung zeigten, dass der neuronale Anteil STAT5-positiver Zellen in diesen hypothalamischen Kerngebieten mit über 90% (außer im ARC mit ca. 80%) sehr hoch war. Neben diesen STAT5-positiven Neuronen konnten zumindest im ARC auch vereinzelte STAT5-positive Astrozyten identifiziert werden. Ein dritter Phänotyp Leptin-responsiver Zellen, die mit einer STAT5-Translokation reagierten, waren Zellen des Ependyms des VIII. Für diesen Zelltyp konnte ein neuronaler und astrozytärer Ursprung ausgeschlossen werden.Um eine Beteiligung anderer Zytokine bei der Induktion der JAK-STAT-Kaskade auszuschließen, wurden Plasma-IL-6- und -TNF-Werte gemessen. Weder für IL-6 noch für TNF konnte eine über den basalen Wert erhöhte Konzentration gemessen werden. Hingegen waren bei allen Tieren die Plasma-Leptin-Konzentrationen um mindestens das 45fache höher gegenüber den Werten der vergleichbaren Kontrolltiere. Als Schlussfolgerung ergibt sich, dass Leptin im Hypothalamus der Ratte seine Effekte über eine Aktivierung von STAT3 und STAT5 vermitteln kann. Für jeden dieser beiden Transkriptionsfaktoren gibt es ein spezifisches Verteilungsmuster funktionell aktivierter Zellen. Die Wirkung von Leptin im Gehirn der Ratte ist nicht nur auf Neurone beschränkt, sondern erstreckt sich auch auf Astrozyten, Endothelzellen, Zellen des PC der Vl und des Ependyms des VIII. Leptin is involved in the regulation of food intake and energy homeostasis as well as in the modulation of various neuroendocrine mechanisms with all those functions predominantly controlled by the hypothalamus. Within the hypothalamus leptin induces its effects via the so called JAK-STAT-signalling pathway and in particular by the activation of the signal transducer and activator of transcription factor 3 (STAT3). However, within many peripheral tissues leptin is also capable of activating another member of the STAT family, e.g. leading to nuclear STAT5 translocation. This thesis neuroanatomically maps those hypothalamic structures within the rat brain that mediate leptin-induced functions via the JAK-STAT-signalling pathway. This is achieved by use of the immunohistochemical detection of leptin-induced nuclear STAT translocation (STAT3 and STAT5) in distinct target cells which in turn gives a map of those hypothalamic structures that can be functionally activated by leptin. Two experimental in vivo models were used for the study. One group of rats was treated with i.c.v. leptin application (3,5 µg of recombinant murine leptin per animal) as compared to the administration of pyrogen-free saline. A second group of rats received an intraperitoneal leptin injection (5 mg of recombinant murine leptin per kg body weight) as compared to the administration of pyrogen-free saline. The animals were then immunohistochemically investigated for nuclear STAT3 or STAT5 translocation. The nuclear translocation was assured with the nuclear DAPI staining. In addition, the phenotype of such leptin-responsive cells was analysed in immunohistochemical co-localization studies by use of distinct neuronal (NeuN), endothelial (vW factor) and astrocytic (GFAP) cell marker proteins. Systemic leptin treatment induced nuclear STAT3-signals with the strongest response (number of responding cells as well as strength of the immunoreactivity) observed 90min after the treatment. In particular the caudobasal hypothalamus with its medial and lateral arcuate nucleus (ARC), dorsomedial aspects of the ventromedial hypothalamic nucleus (VMH), ventral aspects of the dorsomedial hypothalamic nucleus (DMH), the ventral premamillary nucleus (PMV), the retrochiasmatic area (RCH) and the periarcuate area (PAA) proved to be STAT3-responsive. Besides this STAT3-activation in hypothalamic structures leptin induced nuclear STAT3-signals in the brainstem solitary tract nucleus (Sol), in the brain endothelium throughout the entire brain and within cells of the choroid plexus located in the lateral brain ventricles. By use of co-localization studies for the first time a leptin-induced nuclear STAT3-translocation in neurons of various hypothalamic nuclei (vast majority of responding cells), some endothelial cells and cells of the choroid plexus is shown. This observation, without any doubt, provides evidence for a functional role of neurons as well as non-neuronal target cells in the mediation of leptin-induced functions. It is further shown for the first time on the cellular level that besides leptin-induced hypothalamic STAT3-activation, leptin was also capable to induce STAT5-activation within the rat hypothalamus. The STAT5-response due to i.c.v.-stimulation, however, was less convincing due to occurrence of some individual variation. While, with the exception of the supraoptic nucleus (SO), centrally leptin-induced STAT5-activation showed almost no difference to the respective control situation 30min after injection. In contrast, systemic leptin treatment revealed marked differences when compared to the control animals. In more detail, systemic leptin treatment induced nuclear STAT5-signals with the strongest response (number of responding cells as well as strength of the immunoreactivity) observed 120-150min after the treatment. In particular the entire ARC (all subnuclei), the PMV, the SO, the tuberomamillary nucleus (TM) and the RCH showed a nuclear STAT5 translocation. Co-localization studies revealed that a high percentage (80-90%) of those STAT5-responsive cells proved to be neurons. Besides STAT5-positive neurons, some astrocytes within the ARC and ependymal cells of the third ventricle also showed a leptin-induced nuclear STAT5 translocation. To exclude a potential contribution of other cytokines in the activation of the JAK-STAT3- or JAK-STAT5-signalling pathway, we measured plasma concentrations of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor (TNF). Both cytokines showed no elevated plasma levels during systemic leptin-stimulation. In contrast, all systemically leptin-treated rats showed at least a 45fold higher plasma leptin concentration when compared to the respective control animals. In conclusion, it seems that within the rat hypothalamus, leptin can exert its function via the activation of both STAT3 and STAT5. Leptin-induced hypothalamic STAT-analysis showed a distinct pattern of functionally activated target cells for both transcription factors. Besides neurons other non-neuronal cells such as endothelial cells, astrocytes, ependymal cells and cells of the choriod plexus seem to express functional leptin receptors and might thereby mediate leptin-dependent functions in the rat brain.