Nachweis von Brucella sp. bei Meeressäugern der deutschen Nordsee : Phäno- und genotypische Charakterisierung der Isolate sowie serologische Studien

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung und Charakterisierung von aus Meeressäugern der deutschen Nordsee isolierten Brucellen sowie die Klärung ihres Verwandtschaftsgrades mit klassischen Brucella sp. und mit marinen Brucellen anderer geographischer Herkunft. Für die Untersuchungen standen 49 Brucella-Feldisolate, die zwischen 1997 und 2001 aus unterschiedlichen Organen von 28 Seehunden (Phoca vitulina), einem Schweinswal (Phocoena phocoena) und einer Kegelrobbe (Halichoerus grypus) isoliert werden konnten, zur Verfügung. Auf der Basis der phänotypischen Untersuchungen ließen sich alle 49 marinen Isolate der Gattung Brucella, jedoch keiner der bisher bekannten klassischen Brucellenspezies zuordnen. Eine im Rahmen dieser Untersuchungen festgestellte erhöhte NaCl-Resistenz der marinen Isolate im Vergleich zu den klassischen terrestrischen Brucellenarten wurde dabei als Ausdruck einer Anpassung an den Lebensraum Meer gedeutet.Die molekulare Charakterisierung der 49 Brucellen-Isolate erfolgte durch Analyse des omp2-Genlokus und IS711-Fingerprinting. Der omp2-Genlokus, bestehend aus den Genen omp2a und omp2b, wurde u.a. einer PCR-RFLP-Analyse mit 13 Restriktionsenzymen unterzogen, was die Klassifikation von 47 der 49 marinen Feldisolate als Angehörige der erst kürzlich neu vorgeschlagenen Spezies Brucella pinnipediae ermöglichte. Im Rahmen dieser Analyse ließ sich für die Mehrheit (n=44) der marinen Feldisolate dasselbe RFLP-Muster (omp2a:Muster I, omp2b:Muster L) wie für den Referenzstamm NCTC 12890 ermitteln. In Kombination mit dem omp2a-Muster I zeigte ein Stamm das omp2b-Muster O, ein weiterer das omp2b-Muster M und ein drittes Isolat wies ein bisher nicht beschriebens omp2b-Muster auf. Bei den zwei restlichen Isolaten aus zwei verschiedenen Seehunden wichen die omp2b-Muster deutlich von denen der anderen Feldisolate ab und zeigten große Ähnlichkeiten mit dem omp2a-Muster. Durch eine daraufhin eingeleitete Sequenzierung der omp2-Gene dieser Isolate konnte erstmals die Anwesenheit von zwei omp2a-Genen anstelle je eines omp2a- und eines omp2b-Gens bei marinen Brucella-Spezies, ähnlich wie für Brucella ovis beschrieben, nachgewiesen werden. Alle marinen Isolate inklusive der beiden marinen Referenzstämme NCTC 12890 und NCTC 12891 wiesen im Vergleich zu den klassischen Brucellenspezies eine wesentlich höhere IS711-Kopienanzahl im Genom auf. Außerdem konnte bei allen marinen Feldisolaten die als marinspezifisch angesehene IS711-Kopie auf einem ca. 1,7 kbp-großen EcoRI-Fragment detektiert werden. Die IS711-Hybridisierungsmuster lassen auf einen hohen Verwandtschaftsgrad zwischen dem Referenzstamm NCTC 12890, der von einem Seehund der britischen Küste stammt, und den eigenen marinen Feldisolaten schliessen. Schließlich wurden in dieser Arbeit 370 Serumproben von vier unterschiedlichen Meeressäugerspezies (353 Seehunde, 3 Kegelrobben, 13 Schweinswale, 1 Delfin) mittels Langsamagglutination serologisch untersucht. Dabei konnten Brucella-spezifische Antikörper in 13% der Proben von Seehunden sowie in 7,7% der Sera von Schweinswalen nachgewiesen werden. Diese die immunologische Auseinandersetzung der Wirtstiere mit den marinen Brucella sp. widerspiegelnden Daten sind als orientierende epidemiologische Hinweise über die Verbreitung von Brucellen in den Meeressäugerpopulationen der deutschen Nordsee anzusehen. Hinsichtlich der klinischen Bedeutung dieser Bakterien für die marinen Säugetiere ergaben sich im Rahmen dieser Untersuchungen indes keine neuen Aspekte. The aim of the present study was to identify and characterize Brucella strains isolated from marine mammals of the German North Sea and to clarify how they correspond to marine Brucella isolates from other geographical regions.Investigations were performed with 49 Brucella strains isolated between 1997 and 2001 from different organ samples of 28 common seals (Phoca vitulina), one harbour porpoise (Phocoena phocoena) and one grey seal (Halichoerus grypus). According to the classical phenotypic criteria for Brucella differentiation, all 49 isolates were identified as CO2-dependent Brucella sp. not belonging to one of the species known so far. In comparison to the terrestrial species an increased NaCl-resistance of the marine Brucella strains could be stated, indicating a possible strain adaptation to the ecosystem of the ocean.Molecular characterization was performed utilizing the omp2 and IS711 gene loci. The omp2 gene locus, consisting of the omp2a and omp2b gene, was the target of PCR-RFLP studies by use of 13 restriction endonucleases, resulting in the classification of 47 from 49 marine Brucella isolates as members of the recently proposed species Brucella pinnipediae. The majority (n=44) of the marine field strains studied yielded the same RFLP-patterns (omp2a: pattern I, omp2b: pattern L) like the reference strain NCTC12890. Three other strains with omp2a restriction pattern I revealed omp2b patterns of type O, type M and, respectively, of a so far unknown type. As for the remaining two strains originating from two other seals, their omp2b RFLP pattern differed definitely from those of the other marine isolates, in that resembling highly to the omp2a pattern. Sequencing of the omp2 genes of one of the strains revealed the presence of two omp2a genes while an omp2b-gene was lacking. This to my knowledge first demonstration of a twofold omp2a gene presence in a Brucella strain of marine mammal origin has been described before for Brucella ovis only.In comparison to classical Brucella strains all marine Brucella isolates including both marine reference strains NCTC 12890 and NCTC 12891 possessed a definitely higher number of IS711 copies in their genome. The IS711 copy on a 1,7 kbp EcoRI fragment accounted marine specific could be detected in all 49 marine Brucella isolates as well. Hybridization patterns of IS711 indicate a close relationship between the investigated Brucella isolates and the reference strain NCTC 12890 originating from a common seal of the british coast. Serologically, a total of 370 serum samples from four different marine mammal species (353 harbour seals, 3 grey seals, 13 harbour porpoises, 1 dolphin) have been investigated by slow tube agglutination test. Brucella specific antibodies could be detected in 13% of the tested seal samples as well as in 7,7% of the investigated porpoises samples. These results are indicative of an immunological response of the marine hosts to Brucella sp. and can be interpreted as an orientating hint concerning the epidemiological spreading of the agent in the marine mammal population of the German North Sea. As for the clinical significance of these organisms for marine as well as terrestrial hosts further studies are needed.