Phäno- und genotypische Charakterisierung von Staphylococcus aureus aus Ziegenkäse unter besonderer Berücksichtigung des Enterotoxinbildungsvermögens

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden 181 Ziegenkäseproben aus dem Handel (Hessen) auf eine Kontamination mit Staphylococcus (S.) aureus untersucht. In insgesamt 14 Proben (7,7 %) wurde S. aureus nachgewiesen. Aus diesen Proben wurden 64 Isolate von S. aureus ausgewählt. Diese wurden unter Berücksichtigung kultureller, biochemischer und molekularbiologischer Aspekte phäno- und genotypisch charakterisiert. Mittels Enzymimmuntest wurde Enterotoxinbildung bei 29,6 % der Isolate nachgewiesen, dabei wurde Staphylokokken-Enterotoxin C am häufigsten nachgewiesen. Die Überprüfung auf Enterotoxingene ergab für 33 Isolate (51,6 %) positive Nachweise für ein oder mehrere Toxingene. Dabei trugen nur 29,6 % aller Isolate die Toxingene sea und sec. Weitere 22 % der Isolate waren ausschließlich für die 'neueren' Enterotoxingene seg, sei, sem, sen, seo positiv, wobei in allen diesen Isolaten mehrere Toxingene gleichzeitig nachweisbar waren. In 48,4 % der Isolate wurden keine Toxingene nachgewiesen. Für den qualitativen Nachweis der Enterotoxingene wurde eine Multiplex-PCR entwickelt. Die Sensitivität der Multiplex-PCR war bei erheblich geringeren Materialkosten und reduziertem Arbeitsaufwand ausreichend zum Nachweis der Enterotoxingene sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej. Mit dieser Methode gelang der gleichzeitige Nachweis der klassischen und der neuen Enterotoxingene. Ein Vergleich der Ergebnisse mit der Einzel-PCR ergab eine vollständige Übereinstimmung im Bezug auf die neun getesteten Toxingene. Da ein kommerzieller Enterotoxin-Nachweis-Test für die neuen beschriebenen, potentiellen 'Enterotoxine' G bis U zur Zeit nicht erhältlich ist, wurde eine RT-PCR-Methodik zum Nachweis der Genexpression entwickelt. In dieser Arbeit gelang es erstmals, eine RT-PCR für fast alle bekannten Toxingene sea-see, seg, sei, sem, sen, seo zu entwickeln und zu etablieren. Die Ergebnisse der RT-PCR zeigten, dass mit Ausnahme von seo alle nachgewiesenen 'Toxingene' auch tatsächlich von den getesteten S. aureus-Isolaten exprimiert wurden. Diese weisen darauf hin, dass neben den klassischen Enterotoxinen SEA-SEE auch mit 'neuen' Proteinen (Enterotoxinen?) in Ziegenkäse gerechnet werden muss. Ob diese Proteine tatsächlich Toxin-Eigenschaften aufweisen, bedarf weiterer Klärung. Im Gegensatz zur DNA-PCR kann zumindest die tatsächliche Bildung des entsprechenden Proteins als wahrscheinlich angesehen werden. Die Methodik der RT-PCR könnte zur Auswahl geeigneter Stämme im Hinblick auf Proteinisolierung und Antikörperproduktion hilfreich sein. In this study, 181 goat cheese samples collected from retail outlets in Hesse (Germany) were examined for a contamination with Staphylococcus (S.) aureus. S. aureus was identified in 14 samples (7.7 %), and 64 isolates were selected from these samples. Further pheno- and genotypical characterization of the isolates was achieved on the basis of their cultural, biochemical and molecular-biological properties. Enterotoxin production was detected by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 29.6 % of isolates; staphylococcal enterotoxin type C was the most frequent one. After Polymerase Chain Reaction (PCR) analysis, 33 isolates (51.6 %) were found positive for one or more enterotoxin genes, but only 29.6 % of the isolates carried the conventional toxin genes sea und sec. Another 22 % of the isolates were exclusively positive for the 'newer' enterotoxingenes seg, sei, sem, sen, seo, which all contained more than one of these toxin genes. In 48.4 % of the isolates, none of the enterotoxin genes was identified. A multiplex PCR method was developed for the qualitative determination of enterotoxin genes. The method was cost-effective and sensitive enough for the determination of enterotoxin genes sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, and sej. By this technique, it was possible to simultaneously detect both the classical and the newer enterotoxin genes. The results obtained by this method were consistent with those obtained by the single-gene PCR method regarding to the nine tested enterotoxin genes. Since a commercial test for the protein determination of the potential 'toxins' G to U is not available on the market, a Reverse Transcription (RT)-PCR technique was developed for the determination of gene expression. In this work, for the first time a RT-PCR for almost all known toxin genes (sea-see, seg, sei, sem, sen, seo) was developed. The results of the RT-PCR demonstrated that, except of seo, all other 'toxin genes' were actually expressed by S. aureus isolates. Therefore, beside the classical enterotoxins SEA-SEE, the 'new'proteins (enterotoxins?) may also occur in goat cheese. Further studies are required to demonstrate the toxic properties of these proteins. In contrast to the DNA-PCR, by this method is possible to estimate the true production of the respective proteins. The RT-PCR technique could be helpful in the selection of suitable strains for protein isolation and antibody production.