Einfluss des zellulären J-Domänen-Proteins Jiv auf die Replikation von Pestiviren

Abstract

Nichtzytopathogene (nzp) BVDV-Stämme können nach diaplazentarerInfektion von Rinderföten persistierende Infektionen hervorrufen; diesegehen mit einer erworbenen Immuntoleranz gegen das infizierende Viruseinher. Durch Rekombination oder Mutation des viralen RNA-Genomskönnen in diesen persistent infizierten Tieren zytopathogene (zp) Virenentstehen, welche die tödliche Krankheit Mucosal Disease (MD)auslösen. In infizierten Zellkulturen führen zp BVD-Viren zu deutlichenmorphologischen Veränderungen der Zellen, welche als zytopathischerEffekt (ZPE) bezeichnet werden. Zp BVD-Viren bilden in infiziertenZellen große Mengen des viralen Nichtstrukturproteins 3 (NS3) undführen im Gegensatz zu ihren nzp Vorgängern zu einer verstärktenAnhäufung viraler RNA in der Wirtszelle. Diese Arbeit untersucht den Einfluss eines zellulären Proteins aus derFamilie der J-Domänen-Chaperone auf die Replikation von Pestiviren.Dieses Protein interagiert mit dem viralen Nichtstrukturprotein 2 (NS2)und wird daher als Jiv (J-domain protein interacting with viral protein)bezeichnet. Im NS2 befindet sich eine Autoprotease, welche die NS2-3-Spaltung vermittelt. Diese Protease unterliegt einer zeitlichenRegulierung; in nzp BVDV-infizierten Zellen ist sie nur innerhalb derersten Stunden nach der Infektion aktiv. Wird das Jiv-Protein zusammenmit NS2-3 exprimiert, führt es zur NS2-3-Spaltung und damit zurFreisetzung von NS3. Einige zp BVDV-Stämme tragen Jiv-kodierendeSequenzen im NS2-3-kodierenden Bereich ihres Genoms, was einezeitlich unbegrenzte NS2-3-Prozessierung, eine starke RNA-Replikationund den zp Biotyp zur Folge hat. Der zp BVDV-Stamm CP8, dessen Eigenschaften im ersten Teil dieserArbeit beschrieben werden, besitzt im Gegensatz zu den bisherbekannten Stämmen mit Jiv-Insertionen einen unveränderten NS2-3-Bereich. Im N-terminalen Bereich des Polyproteins dieses Stammesbefinden sich zwei Fragmente des zellulären Jiv innerhalb einerkomplexen Insertion zellulären und viralen Ursprungs. Infolgedessenwird zusätzlich zu den regulären pestiviralen Proteinen ein 513 ASgroßes Jiv-Fusionsprotein exprimiert, welches aufgrund des enthaltenenJiv-Anteils die NS2-3-Spaltung in trans induzieren kann. Damitunterscheidet sich BVDV CP8 von allen bisher bekannten zp BVDVStämmenund stellt daher eine neue Variante innerhalb der vielenverschiedenen Möglichkeiten von Genomveränderungen dar, die zurZytopathogenität führen. Im zweiten Teil der Arbeit wird der Einfluss des zellulären Jiv-Spiegelsauf die Replikation von Pestiviren untersucht. Es stellte sich die Frage,ob Jiv einen essentiellen Wirtsfaktor für die pestivirale Replikationdarstellt. Durch vergleichende Studien in Wildtyp-Wirtszellen und JivüberexprimierendenZellen bzw. Jiv-'knockdown'-Zellen konnte gezeigtwerden, dass die Erhöhung bzw. die Verminderung der in der Wirtszellevorhandenen Jiv-Menge direkt mit der Replikationseffizienz von nzpBVDV korreliert. Jiv besitzt die Fähigkeit, über die Regulation der NS2-3-Prozessierungdie virale Replikation zu kontrollieren. An Gewebekulturzellen zeigtesich, dass der intrazelluläre Jiv-Spiegel die Replikation von nzp BVDVlimitiert. Dieser hier nachgewiesene Kontrollmechanismus istentscheidend für den viralen Biotyp und daher für die Fähigkeit von nzpBVDV, in seinem Wirt zu persistieren. After diaplacentar transmission noncytopathogenic (noncp) BVDV strainsare able to cause persistent infections of calves. Viral persistence isassociated with a specific acquired immunotolerance concerning thepersisting virus. In the persistently infected animal the emergence of acytopathogenic (cp) virus from its noncp ancestor by recombination ormutation of the viral RNA genome results in lethal Mucosal Disease. Incell culture cp BVDV causes severe morphologic alterations of theinfected cells, which are referred to as cytopathic effect (CPE). Largeamounts of nonstructural protein 3 (NS3) are produced upon cp BVDVinfection leading to an enhanced accumulation of viral RNA whencompared to noncp BVDV infected cells. This work analyses the influence of a cellular protein belonging to thefamily J-domain chaperons on pestiviral replication. This protein interactswith the viral NS2 and is therefore termed Jiv (J-domain proteininteracting with viral protein). In the NS2 protein an autoprotease resideswhich mediates NS2-3 cleavage. This protease is temporally regulated;in noncp BVDV infected cells its activity is restricted to the first hoursafter infection. Coexpression of the Jiv protein and NS2-3 leads to NS2-3cleavage and thereby to the release of NS3. Some cp BVDV strainsencompass Jiv-coding sequences in the NS2-3-coding region causingtemporally unlimited NS2-3 cleavage, high level RNA replication and thecp biotype. In the first part of this work the characteristics of the cp BVDV strain CP8are described. This strain contains in contrast to all other known cpBVDV strains a Jiv-insertion located apart from the NS2-3 region. Theinsertion is located in the N-terminal region of the polyprotein andincludes two fragments of cellular Jiv in the context of a complexinsertion of cellular and viral origin. This results in the expression of aJiv-fusion protein with a length of 513 amino acids in addition to a regularset of viral proteins. Due to its Jiv-portion the Jiv-fusion protein is capableof inducing NS2-3 cleavage in trans. Thereby BVDV CP8 differs from allother cp BVDV strains and represents a new type among the numerouspossible genomic variations leading to cytopathogenicity. In the second part of this work the influence of the cellular Jiv level onviral replication has been studied. The question arose whether Jiv maybe a host factor which is essential for pestiviral replication. Comparativestudies based on wildtype host cells, Jiv-overexpressing cells and Jivknockdowncells demonstrated a direct correlation between the cellularJiv level and the replication efficiency of noncp BVDV. Jiv has the ability to control viral replication by regulating NS2-3processing. For tissue culture cells the limitation of noncp BVDVreplication by the intracellular Jiv level was demonstrated. This controlmechanism is crucial for the determination of the viral biotype andthereby for the persistence of noncp BVDV in its host.