Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der IP3-Rezeptorsubtypen im Kolonepithel der Ratte

Abstract

Die Stimulation einer Reihe von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren löst amKolonepithel, vermittelt durch die Aktivierung einer Phospholipase C und daraus resultierender Bildung von Inositol-1,4,5-trisphosphat (= IP3), eine Freisetzung von Ca2+-Ionen aus intrazellulären Speichern aus, woraus funktionell eine sekretorische Diarrhoe entsteht. Ziel der Arbeit war es, am Kolonepithel der Ratte die exprimierten IP3-Rezeptorsubtypen, ihre Lokalisation innerhalb des Kolonepithels sowie die mögliche funktionelle Bedeutung der verschiedenen Subtypen zu identifizieren. Der Typ 1 IP3-Rezeptor (= IP3R1) konnte immunhistochemisch im Kolonepithelnicht nachgewiesen werden, während der Typ 2 IP3-Rezeptor (= IP3R2) in denEpithelzellkernen der Krypte und des Oberflächenepithels gefunden wurde. Durch Doppelfärbungen mit Lamin B1 und elektronenmikroskopische Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor im Nukleoplasma exprimiert wird. Der Typ 3 IP3-Rezeptor (= IP3R3) hingegen ist im apikalen Zytoplasma der Epithelzellen lokalisiert. Dieser Subtyp zeigt einen Gradienten entlang der Kryptenachse, da seine Expression von der Oberflächenregion zur Fundusregion hin massiv abnimmt, wo dieser Rezeptorsubtyp nicht mehr detektiert werden konnte. Um die funktionelle Rolle der beiden Subtypen zu untersuchen, wurden Ca2+-Imaging-Experimente durchgeführt. Zuerst sollte geklärt werden, ob sich der IP3R3-Gradient entlang der Kryptenachse auf Ca2+-Signale, die durch Stimulation des Phospholipase C / IP3-Signalweges entstehen, auswirkt. Stimulation von purinergen Rezeptoren mit ATP an intakten, isolierten Kolonkrypten löste aber in allen untersuchten Kryptenabschnitten (Oberflächenregion, Mitte, Fundus) eine gleich starke sowie gleich schnelle Ca2+-Antwort aus. Auch eine Stimulation von saponinpermeabilisierten Krypten mit IP3 selbst oder dem IP3-Agonisten Adenophostin A rief gleich starke Antworten in allen Kryptenabschnitten hervor. Nur das hoch affine Adenophostin konnte eine schnellere Antwort in der Oberflächenregion hervorrufen, also in dem Kryptenabschnitt, in dem sowohl nukleäre IP3R2 als auch zytoplasmatische IP3R3 exprimiert werden. Die Verteilung des IP3R3 bedingt damit keinen wesentlichen funktionellen Gradienten entlang der Kryptenachse; der nukleäre IP3R2 scheint also für die Stimulation des Ca2+-Signalweges am Kolonepithel ausreichend zu sein. Diese Schlussfolgerung wurde durch Imaging-Experimente an isolierten Epithelzellkernen untermauert, an denen eine IP3-Exposition Änderungen in der Ca2+-Konzentration hervorrief, die sich durch den IP3-Rezeptorblocker 2-Aminoethoxy-diphenylborat (2-APB) unterdrücken ließen. Dem nukleären IP3R2 scheint damit eine zentrale Rolle im Ca2+-Signalweg des Kolonepithels zuzukommen. At colonic epithelium, the stimulation of G-protein coupled receptors induces the activation of a phospholipase C and the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (= IP3), which causes a Ca2+ release from intracellular stores. The functional consequence is the induction of a secretory diarrhea. The aim of this study was to identify in rat colonic epithelium the expressed IP3 receptor (= IP3R) subtypes, their localization inside the colonic epithelium and the putative functional role of the different subtypes. The type 1 IP3-receptor (= IP3R1) could not be detected immunohistochemically in the colonic epithelium, whereas the type 2 IP3-receptor (= IP3R2) was found in the nuclei of the crypt and the surface epithelium. A double labelling with lamin B1 and electron microscopy showed that the IP3R2 is localized in the nucleoplasm. In contrast, the type 3 IP3-receptor (= IP3R3) is expressed in the apical cytoplasm of the epithelial cells. This receptor shows a pronounced gradient along the crypt axis, because its expression decreases from the surface to the crypt fundus, where the receptor could not be detected. To reveal the functional role of the receptor subtypes, Ca2+ imaging experiments were performed. It should be investigated whether the IP3R3 gradient along the crypt axis affects Ca2+ signals, which are induced by stimulation of the phospholipase C / IP3 signalling pathway. Stimulation of purinergic receptors with ATP at intact, isolated colonic crypts induced an increase in the intracellular Ca2+ concentration of similar amplitude and time course in all investigated regions of the crypt (surface region, middle, fundus). Also a stimulation of saponin-permeabilized crypts with IP3 itself or the IP3-agonist, adenophostin A, resulted in a Ca2+ release of similar size. Only adenophostin A with its high affinity for IP3Rs evoked a faster reaction in the surface region, i.e. the region which expresses both the nuclear IP3R2 and the cytoplasmic IP3R3. Consequently, the unequal distribution of the IP3R3 along the crypt axis causes no essential functional gradient; the nuclear IP3R2 seems to be sufficient for the stimulation of the Ca2+ signalling pathway in the colonic epithelium. This conclusion could be confirmed by imaging experiments at isolated nuclei, which showed changes in the Ca2+ concentration after exposure to IP3. These effects could be suppressed by the IP3 receptor blocker 2-aminoethoxy diphenylborate (= 2-APB). Therefore, the nuclear IP3R2 seems to bear a central role in Ca2+ signalling pathways at the colonic epithelium.