Nachweis von Apoptose am Magen- und Darmepithel des Pferdes mittels TUNEL-Methode und Immunhistochemie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, die Apoptose-Rate der Epithelzellen des Magen-Darm-Traktes (MDT) von adulten Pferden und Fohlen zu untersuchen.Die Apoptose spielt eine wichtige Rolle in den physiologischen und dynamischen Vorgängen des Zellumsatzes im Epithel des MDT. Aber auch bei einigen pathologischen Veränderungen des MDT ist die Apoptose von Bedeutung.Zum Nachweis der Apoptose wurde die TUNEL-Methode und ein Lamin A-Antikörper verwendet. Dabei wurde nicht nur auf organspezifische, sondern auch auf regionale Unterschiede geachtet. Außerdem wurde besonderer Augenmerk auf den Vergleich der Apoptose-Rate beider Altersgruppen gelegt. Bei 6 adulten Pferden und 3 Fohlen wurden hierzu jeweils 9 definierte Proben aus dem MDT direkt nach dem Tod der Tiere entnommen und kryokonserviert. Anschließend wurden die Proben für eine lichtmikroskopische und darauffolgende immunhistochemische Untersuchung aufbereitet. Apoptotische Zellkerne (ZK) wurden mittels der TUNEL-Methode und der Lamin A-Färbung sichtbar gemacht. Der Anteil der TUNEL-positiven bzw. der Lamin A-negativen ZK/Zellen an der Gesamtpopulation wurde als Apoptose-Rate in % angegeben. Es handelt sich bei den Zahlenwerten um den geometrischen Mittelwert der Apoptose-Rate. Die Ergebnisse der Apoptose-Rate (A.-R.) mit der TUNEL-Methode für den Magen der adulten Pferde (A.-R. = 0.330%) im Vergleich zu denen der Fohlen (A.-R. = 0,271%) ergaben keine signifikanten Unterschiede. Ebenso verhielt es sich mit der Rate der Lamin A-negativen ZK beim Magen der adulten Pferde (A.-R. = 0,457%) im Vergleich zu den Fohlen (A.-R. = 0,451%). Dabei befanden sich die apoptotischen ZK bei beiden Methoden hauptsächlich im Oberflächenepithel. Für den Dünndarm ergaben sich bei der TUNEL-Methode signifikante Unterschiede für die Apoptose-Rate bei den adulten Pferden (A.-R. = 0,103%) im Vergleich zu den Fohlen (A.-R. = 0,522%). Die Apoptose-Rate war bei den adulten Pferden signifikant niedriger als bei den Fohlen (p = 0,015). Dagegen war die Apoptose-Rate mit der Lamin A-Methode für die adulten Pferde (A.-R. = 1,995%) höher als für die Fohlen (A.-R. = 1.503%). Dieser Unterschied war allerdings nicht signifikant. Ebenso wie beim Magen befanden sich die apoptotischen ZK hauptsächlich im Oberflächenepithel und vor allem an den Zottenspitzen. Bei den Lamin A-negativen ZK fiel auf, dass sich hier auch viele markierte ZK in tieferen Bereichen der Schleimhaut befanden. Die Ergebnisse der Apoptose-Raten für den Dickdarm ergaben bei beiden Methoden im Vergleich zwischen den adulten Pferden und den Fohlen einen nennenswerten Unterschied. Die Apoptose-Rate war mit der TUNEL-Methode bei den adulten Pferden (A.-R. = 0,218%) deutlich niedriger als bei den Fohlen (A.-R. = 0,753%), jedoch nicht signifikant (p = 0,089). Die Apoptose-Rate mit der Lamin A-Methode war ebenfalls bei den adulten Pferden (A.-R. = 1,977%) niedriger als bei den Fohlen (A.-R. = 2,624%), jedoch nicht signifikant (p = 0,140).Der Hauptanteil der apoptotischen ZK befand sich auch beim Dickdarm im Oberflächenepithel. Die TUNEL-Methode stellt eine gute Methode zum Nachweis von Apoptose am Pferdedarm dar. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Studie ist sie die Methode der Wahl, die sich auch zur Quantifizierung der Apoptose im Schleimhautepithel sehr gut eignet. Die Lamin A-Methode birgt das Risiko, intraepitheliale Lymphozyten als falsch negativ (und damit apoptotisch) zu beurteilen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die Apoptose-Raten des Darmepithels bei den adulten Pferden niedriger lagen als bei den Fohlen. Dieser globale Unterschied zwischen den Altersgruppen war signifikant (p = 0,010). Dies ist wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Entwicklung des noch immaturen Fohlendarmes zu sehen. The objective of the present study was to investigate apoptosis of epithelial cells in the stomach and the intestine of adult horses and foals.Apoptosis plays an important role in the physiological dynamic process of cell turnover in the epithelium of the stomach and the intestine. Moreover increased or decreased apoptosis takes place in various pathological alterations of the stomach and the intestine. The apoptotic process is a complex process involving a number of mediators. For the detection of apoptosis the TUNEL-method and a lamin A-antibody was applied. Special interest was to see if there would be either tissue-specific and/or regional differences. Furthermore there was focus on the differences in apoptosis comparing the gastrointestinal epithelium of adult horses and foals.Defined epithelium tissue specimen (n = 9) were taken out of the stomach and the intestine of 6 adult horses and 3 foals directly after the animals were killed. Then the tissue was immediately cryopreserved. After that the epithelial specimen were prepared for lightmicroscopical and following immunohistochemical investigation. The TUNEL-method and a lamin A-antibody were used to detect apoptotic nuclei. The part of TUNEL-positive and lamin A-negative nuclei were given by the apoptotic rate in percent. The apoptotic rate was given as geometric mean. The results of the apoptotic rate of the stomach with the TUNEL-method showed, that there was no signifikant difference between the adult horses (a. r. = 0,330%) and the foals (a. r. = 0,271%). The results of the apoptotic rate with the lamin A-antibody also demonstrated no significant difference between the adult horses (a. r. = 0,457%) and the foals (a. r. = 0,451%) in the stomach epithelium. The main part of the apoptotic nuclei was localized at the surface epithelium of the stomach for both methods. In the small intestine the TUNEL-method showed a significant difference in the epithelial apoptotic rate of the adult horses (a. r. = 0,103%) in comparison with the foals (a. r. = 0,522%). The apoptotic rate was significantly lower in adult horses than in foals (p = 0,015). In contrast the lamin A-method demonstrated an increased apoptotic rate in the small intestinal epithelium of the adult horses (a. r. = 1,995%) in comparison with the foals (a. r. = 1,503%), but this difference was not significant. Like in the stomach the main part of the apoptotic nuclei was localized within the surface epithelium of the small intestine, especially at the tip of the villi. Certainly the lamin A-method showed more apoptotic nuclei in other locations. The results for the apoptotic rates of the large intestine showed in both methods a visible difference between the adult horses and the foals. The apoptotic rate for the large intestine with the TUNEL-method was lower in the adult horses (a. r. = 0,218%) compared to the foals (a. r. = 0,753%), but the difference was not significant (p = 0,089). The results of the apoptotic rate with the lamin A-method also demonstrated a lower apoptotic rate in the adult horses (a. r. = 1,977%) compared to the foals (a. r. = 2,624%), but this difference was also not significant (p = 0,140). In the large intestine the main part of the apoptotic nuclei was also localized in the surface epithelium for both methods. The TUNEL-method is a good method for detection of apoptotic nuclei in the epithelium of the equine intestine. As the present study showed, the TUNEL-method is very suitable for quantification of apoptotic nuclei in the intestinal mucosa. The lamin A-method brings a possible risk of counting intraepithelial lymphocytes as false negative (and apoptotic).In conclusion the results of this study demonstrated that the apoptotic rates of the intestinal epithelium were lower in adult horses compared with foals. This global difference between the two ages was significant (p = 0,010). This is probably due to developmental changes of the immature intestine of foals.