Identifizierung von fünf Tegumentproteinen (UL37, UL46, UL47, UL48, UL49) sowie von zwei Nichtstrukturproteinen (UL31, gG) des Virus der infektiösen Laryngotracheitis der Hühner und Evaluierung einer UL47-Deletionsmutante als potentielle Lebendvirus-Vakzine

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden die ILTV-Homologen von sieben konservierten alphaherpesviralen Genen untersucht. Durch Northern Blot-Analysen wurden die viralen mRNAs identifiziert und deren Expressionskinetik in infizierten Zellen bestimmt. Mit Hilfe monospezifischer Antiseren, die nach Immunisierung von Kaninchen mit bakteriellen Fusionsproteinen erhalten wurden, konnten die entsprechenden viralen Proteine nachgewiesen werden. Diese zeigten in Western Blot-Analysen apparente Massen von 33,4 kDa (UL31), 112 kDa (UL37), 64,2 kDa (UL46), 65,6 kDa (UL47), 44,8 kDa (UL48), 33,5 kDa (UL49) und 52,3-70,7 kDa (US4). Die Massen der UL31-, UL37- UL48- und UL49-Genprodukte entsprachen den Erwartungen. Die UL46-, UL47- und US4-Proteine hingegen waren gegenüber den in vitro-Translationsprodukten deutlich vergrößert, was auf posttranslationale Modifikationen hinwies. Studien mit Hemmstoffen und Glykosidasen ergaben, dass das US4-Genprodukt von ILTV N-glykosyliert ist und deshalb wie seine Homologen als gG bezeichnet werden kann. Wie einige der homologen Glykoproteine wird das gG von ILTV von infizierten Zellen sezerniert, aber nicht in Virionen eingebaut. Auch das UL31-Genprodukt ist offensichtlich ein Nichtstrukturprotein, während die UL37-, UL46-, UL47-, UL48- und UL49-Genprodukte wie die entsprechenden Tegumentproteine anderer Herpesviren in reifen ILTV-Partikeln nachweisbar waren. Durch indirekte Immunfluoreszenztests konnte gezeigt werden, dass die Genprodukte von UL31 und UL48 vor allem im Kern, die von UL37, UL46, UL47, UL49 und US4 überwiegend im Zytoplasma infizierter Zellen lokalisiert sind. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Kernlokalisation des UL48-Proteins mit einer transaktivierenden Wirkung auf die virale immediate-early-Genexpression korreliert. In zahlreichen Versuchen gelang es nicht, UL31-, UL37-, UL46-, UL48- oder UL49-negative ILTV-Rekombinanten zu isolieren, was auf wichtige Funktionen dieser Gene hindeutete. Dagegen konnte durch die Herstellung von UL47- und US4-Deletionsmutanten gezeigt werden, dass die entsprechenden Proteine für die Virusreplikation in Zellkultur entbehrlich sind. Während die Deletion des gG-Gens US4 keine erkennbaren Auswirkungen hatte, war die Replikation von UL47-negativem ILTV deutlich verlangsamt, und die maximalen Virustiter waren gegenüber dem Wildtypvirus und einer UL47-Revertante etwa zehnfach reduziert. Durch einen Tierversuch konnte gezeigt werden, dass ILTV-deltaUL47 auch in vivo attenuiert ist und dass mit dieser Rekombinante immunisierte Hühner gegen eine Belastungsinfektion mit pathogenem Wildtypvirus geschützt sind. Die hergestellte Mutante könnte deshalb als Lebendvirus-Vakzine zur Bekämpfung der ILT geeignet sein. In the present study the ILTV-homologues of seven conserved alphaherpesvirus genes were investigated. The viral mRNAs were detected, and their expression kinetics in infected cells were determined by Northern blot analyses. The viral proteins were identified using monospecific antisera obtained after immunization of rabbits with bacterial fusion proteins. In Western blot analyses the viral proteins exhibited apparent masses of 33.4 kDa (UL31), 112 kDa (UL37), 64.2 kDa (UL46), 65.6 kDa (UL47), 44.8 kDa (UL48), 33.5 kDa (UL49) and 52.3-70.7 kDa (US4). While the masses of the UL31, UL37, UL48 and UL49 gene products agreed with the expectations, the UL46, UL47 and US4 proteins were larger than the corresponding in vitro translation products indicating posttranslational modifications. Treatment with glycosylation inhibitors and glycosidases demonstrated that the US4 gene product of ILTV is N-glycosylated and, therefore, like its homologues, should be named Glycoprotein G. Like several of the homologous glycoproteins, ILTV gG is secreted by infected cells, but not incorporated in virions. UL31 encodes a non-structural protein, whereas the UL37 and UL46 - UL49 gene products were detectable in mature ILT virions, like the corresponding tegument proteins of other herpesviruses. Indirect immunofluorescence tests revealed that the UL31 and UL48 proteins accumulated in the nuclei of infected cells, whereas the UL37, UL46, UL47, UL49 and US4 proteins were predominantly located in the cytoplasm. Coinciding with its nuclear localisation the UL48 protein of ILTV was characterised as a trans-activator of viral immediate-early gene expression. Several attempts to isolate UL31, UL37, UL46, UL48 or UL49 negative ILTV recombinants failed, indicating that these genes possess important functions. In contrast, successful isolation of UL47 and US4 deletion mutants demonstrated that the respective proteins are dispensable for virus replication in cell culture. Whereas deletion of the gG gene US4 had no detectable effects, replication of UL47 negative ILTV was significantly delayed, and maximum virus titers were reduced nearly tenfold compared to wild-type virus and a UL47 rescue mutant. An animal trial demonstrated that ILTV-deltaUL47 was attenuated in vivo, and able to protect immunised chickens against subsequent challenge infection with pathogenic wild-type virus. Thus, the generated virus mutant might be suitable as a live virus vaccine to combat ILT.