Etablierung und Evaluierung eines Capture-ELISAs zum Nachweis des Beta2-Toxins von Clostridium perfringens aus Feldisolaten

Abstract

Beta2-Toxingen-positive C. perfringens Typ A- und C-Stämme werden häufig bei Durchfallerkrankungen von Saugferkeln isoliert. Die Bedeutung des Beta2-Toxins in der Pathogenese ist bisher nicht eindeutig geklärt. Der Nachweis Beta2-Toxingen-positiver Stämme, die mittels PCR identifiziert werden, läßt keinerlei Aussage darüber zu, ob und wie viel Beta2-Toxin während der Vermehrung in den Kulturüberstand exprimiert wird. Es wurde daher versucht, eine quantitative Methode zu entwickeln, die eine Bestimmung des Beta2-Toxingehalts in C. perfringens-Kulturüberständen erlaubt.Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit ein Fangantikörper-ELISA zum Nachweis von Beta2-Toxin aus C. perfringens-Kulturüberständen entwickelt. Der Test wurde auf seine Eignung für den quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kulturüberständen, die von Isolaten aus Kotproben gesunder und durchfallerkrankter Ferkel gewonnen wurden, geprüft. Mittels pASK-IBA2 Vektor gelang die gezielte Expression eines rekombinanten Beta2-Toxins aus E. coli. Unter Verwendung des affinitätchromatographisch aufgereinigten rBeta2-Toxins konnten nach Immunisierung, Wildtyptoxin-erkennende polyklonale (pAk) und zwei monoklonale Antikörper (2-4A5 und 2-4C11) gewonnen werden. Unter Verwendung von C. perfringens-Kulturüberständen sowie Kulturüberständen weiterer grampositiver und gramnegativer Keime wurde der entwickelte Fangantikörper-ELISA auf Reproduzierbarkeit, Verdünnungsechtheit, Sensitivität und Spezifität getestet.Mittels Inter-Assay-Präzision wurde die Reproduzierbarkeit bzw. der Grad der Schwankungen des ELSIA zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei wiederholter Testung gemessen, wobei der Variationskoeffizient <20% betrug, was einer hinreichenden Genauigkeit entspricht.Mittels Intra-Assay-Präzision wurden die Schwankungen innerhalb eines Ansatzes überprüft und die gute Reproduzierbarkeit des Systems, mit einem Variationskoeffizienten <20%, bestätigt. Die Sensitivität des Beta2-spezifischen Fangantikörper-ELISAs lag nach Untersuchungen mit 18 genotypisch Beta2-positiven C. perfringens-Feldisolaten bei 100 %.Kulturüberstände anderer Clostridienspezies sowie grampositiver und gramnegativer Keime zeigten keinerlei Kreuzreaktion mit den im Fangantikörper-ELISA verwendeten Nachweisantikörpern. Daraus ergab sich eine Diagnostik-Spezifität von 100%.48 C. perfringens-Feldisolate, die von Kotproben gesunder und kranker Ferkel stammten, wurden mittels des Beta2-spezifischen Fangantikörper-ELISAs untersucht. Der gemessene Beta2-Toxin Gehalt in den Kulturüberständen von Isolaten aus Kotproben erkrankter Tiere, zeigte bei beiden mAk (2-4A5 und 2-4C11) fünffach höhere Werte als die bei den Isolaten gesunder Saugferkel. Im genotypischen Nachweis handelte es sich um 88 % Typ A-Stämme und 12 % Typ C-Stämme.Darüber hinaus wurde untersucht, ob bei nativem und rekombinantem Beta2-Toxin eine zytotoxische Wirkung nachgewiesen werden kann. An verschiedenen Zelllinien ließ sich sowohl für das native als auch das rekombinante Toxin eine Zytotoxität nachweisen, wobei das native Beta2-Toxin eine bis zu achtfach höhere Zytotoxizität gegenüber dem rekombinant hergestellten Beta2-Toxin aufwies. In weiteren Versuchen an Kaninchen- und Ferkelerythrozyten zur Hämolyse-Wirkung von Alphatoxin war festzustellen, dass die Alphatoxin-induzierte Hämolyse durch Zugabe von rBeta2-Toxin signifikant gesteigert werden konnte, was deutliche Hinweise auf einen Synergismus beider Toxine gibt. Dies wird bestätigt durch die Tatsache, dass sich dieser Effekt durch Zugabe des Beta2-spezifischen mAk 2-4C11 zum Präinkubationsgemisch (rBeta2 und PLC) aufheben ließ.Der hier entwickelte Fangantikörper-ELISA stellt eine geeignete Methode zum quantitativen Nachweis von Beta2-Toxin in C. perfringens-Kulturüberständen unter Routinebedingungen dar. C. perfringens Type A and C strains which produce Beta2-toxins, are often isolated during diarrhoea. The exact meaning of these Beta2-toxins are yet unknown. No assumption can be made, by PCR determined Beta2-toxin positive C. perfringens species, if and how much Beta2-toxin is expressed in the culture supernatant. Hence, the aim of this study was to establish a quantitative method, a Capture-ELISA, which determines the Beta2-toxin concentration in culture supernatant of C. perfringens. Its suitability was tested with C. perfringens isolates derived from faecal samples of healthy and diarrhoea sick piglets.A focused expression of the recombined Beta2-toxin from E. coli was achieved, using a pASK -IBA2 vector. The use of purified recombined Beta2-toxin, through affinity chromatography, enabled the gain of wildtype toxin recognising polyclonal (pAB) and monoclonal antibodies (mAB, 2-4A5 and 2-4C11), after immunisation.Culture supernatant of C. perfringens, and also the culture supernatant of other Gram positive and Gram negative bacteria were used to test and determine the reproducibility, dilution authenticity, sensitivity and specificity of the established Capture-ELISA.Inter/Intra-Assay-Precision Tests examined the reproducibility and respectively, the fluctuation of the Capture-ELISA at different time intervals, as well as within each trial attempt. In both cases, a coefficient of variation < 20% resulted, indicating a sufficient accuracy.The sensitivity of the Beta2-specific Capture-ELISA was 100%, after the analyses of 18 genotypical Beta2-positive C. perfringens field isolates.Culture supernatants of other Clostridia species, Gram negative and Gram positive bacteria showed no cross reaction with the Capture-ELISA used antibodies. Therefore, a diagnostic specificity of 100% is given.48 C. perfringens field isolates, which were obtained from faecal samples of healthy and sick piglets, were analysed with the Beta2-specific Capture-ELISA. Faecal samples of the sick piglets showed fivefold higher concentrations of Beta2-toxin for both mABs (2-4A5 and 2-4C11) compared to fecal samples of the healthy piglets. C. perfringens Type A strains represented 88% and C. perfringens Type C strains represented 12% within the faecal samples.Possible cytotoxic effects of native and recombined Beta2-toxin were also examined. Both native and recombined Beta2-toxin showed cytotoxic effects in different cell lines, although the cytotoxic effect of native Beta2-toxin was eightfold higher than that of the recombined Beta2-toxin. The addition of the recombined Beta2-toxin provoked a significant increase of α toxin- induced haemolysis, indicating a synergistic effect for both toxins. This effect is abolishable when adding Beta2-specific mAB 2-4C11 in the preincubation mixture of the recombined Beta2-toxin with PLC.The established Capture-ELISA is a useful method for the quantitative determination of Beta2-toxin in C. perfringens culture supernatants under routine conditions.