Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von Stammzellen des Spiralganglions

Abstract

Über die Mikrodissektion des Spiralganglions und die Kultivierung der Zellen konnten sphärenbildende Stamm- und Vorläuferzellen isoliert werden. Diese Neurosphären wurden anhand ihrer Morphologie, der Proliferationsaktivität und Expression von Nestin bis zur tertiären Generation näher charakterisiert. Morphologisch zeigten sich innerhalb der Sphären kaum Unterschiede. Anhand der Proliferation und Expression von BrdU und Ki-67 stellte sich heraus, dass Sphären bis hin zur tertiären Generation mitotisch aktiv sind und den Stamm- und Progenitorzellmarker Nestin exprimieren.Des Weiteren waren einzelne Stammzellen des Spiralganglions zu klonalem Sphärenwachstum in der Lage. Einen enormen Einfluss auf die Klonalität von Sphären hatten der Versuchsaufbau sowie der Experimentator. Durch Bewegung der Platten, hohe Zelldichte, lange Kultivierungsdauer und Verwendung sekundärer anstelle primärer Sphären konnte das klonale Wachstum von Sphären negativ beeinflusst werden. Über die Einschränkung der Beweglichkeit von Zellen und der Unterbindung von Konglomeration in Form semisolider Medien konnte diese Anfälligkeit für Chimärismus stark reduziert werden. Selbst bei Platzierung einer Einzelzelle pro Well zeigten die Zellen des Spiralganglions in vollständiger Isolation zu anderen Zellen die Fähigkeit der Sphärenbildung. Zell-Zell-Interaktionen schienen daher kein obligater Parameter für die Generierung klonaler Sphären zu sein.Neuronale und gliale Zellen differenzierten aus aktiv durch Teilung entstandenen neuen Zellen und wurden über Marker detektiert. Diese Multipotenz ist eine weitere wichtige Eigenschaft von Stammzellen. Die Morphologie dieser Zellen gab weitere wichtige Hinweise darauf, dass Neurone und Gliazellen aus Sphärenzellen entstehen können. Die dargelegten Versuche zeigen, dass das neonatale Spiralganglion Stammzellen enthält, die die definierenden Eigenschaften von Stammzellen aufweisen (McKay 1997). Sie verfügen über ein hohes proliferatives Potential, sind zur Selbsterneuerung fähig und können in reife Zelltypen des Innenohrs ausdifferenzieren. Diese Charakteristika zeigen, dass im neonatalen Spiralganglion die Fähigkeit zur Regeneration durch Stammzellen vorhanden sein könnte. Mit der Möglichkeit, diese Zellen zu isolieren und zu differenzieren, werden neue therapeutische Wege eröffnet. Sphere-forming stem- and progenitor cells could be isolated by microdissection of the spiral ganglion and cultivation of these cells. The neurospheres were characterized based on morphology, proliferation and expression of nestin until the third generation. Morphologically hardly any difference could be detected. Proliferation and expression of Ki-67 and BrdU revealed that spheres are not just mitotically active until the third generation but also express the stem- and progenitor cell marker nestin.Moreover, solely stem cells of the spiral ganglion were able to grow clonally. A huge influence on clonality of spheres had the experimental conception as well as the experimenter. Motion of the plates, high cell density, long cultivation duration but also the usage of secondary instead of primary spheres had a negative impact on the clonal growth of spheres. Restricted motility of cells and the restraint of conglomeration, using semisolid media, resulted in less chimerism. Even if just a single cell was placed per well, cells of the spiral ganglion did not lose the ability for sphere formation. Cell-cell-interaction did not seem to be an obligated parameter for the creation of clonal spheres.Neuronal and glial cells differentiated from mitotically active, newly emerged cells, these were detected with markers. This multipotency is another main feature of stem cells. The morphology of these cells indicated that neurons and glial cells can be generated from sphere cells.Presented experiments showed that the neonatal spiral ganglion contains stem cells, displaying defining features of stem cells (McKay 1997). They possess a high proliferative potential, the capacity for self-renewal and they can differentiate into mature cells of the inner ear. These characteristics reveal that the neonatal spiral ganglion potentially could have the ability for the regeneration by stem cells. The opportunity to isolate and differentiate those cells will open new therapeutic ways.