Phäno- und Genotypisierung von Bakterien des Genus Arcanobacterium unter besonderer Berücksichtigung von Arcanobacterium phocae

Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen konnten 11 Referenzkulturen von neun Speziesder Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella, 43 A. phocae-Kulturen, isoliert vonSeehunden und einer Kegelrobbe, sieben A. haemolyticum-Kulturen, isoliert von Pferden, eineA. pluranimalium-Kultur, isoliert von einem Hund, drei A. (T.) bialowiezense-Kulturen undsieben A. (T.) bonasi-Kulturen, isoliert vom Europäischen Bison, zwei A. (T.) pyogenes-Kulturen, isoliert von einer Bartagame und einem Gecko, und 26 A. (T.) pyogenes-Kulturen,isoliert von Rindermastitiden, phänotypisch und genotypisch identifiziert und weitergehendcharakterisiert werden.Die Identifizierung der Arcanobacterium- bzw. Trueperella-Kulturen war aufgrund vonkulturellen Eigenschaften, durch Nachweis der Hämolyse bzw. synergistischer oderantagonistischer Hämolysereaktionen und durch Nachweis biochemischer Eigenschaftenmöglich. Eine molekulare Charakterisierung der Arcanobacterium- bzw. Trueperella-Kulturen erfolgte durch 16S rDNA-Analysen und, als bislang für diese Gattungen noch nichtbeschriebene Gen- bzw. Genomabschnitte, durch Sequenzierung der 16S-23S rDNAintergenic spacer-Region (ISR), der 23S rDNA, des Superoxid Dismutase A-kodierendenGens sodA und durch Sequenzierung des die Beta-Untereinheit der RNA-PolymerasekodierendenGens rpoB. Die Ergebnisse der ISR- bzw. der 16S rDNA und 23S rDNASequenzierungenführten zur Erstellung von spezifischen Oligonukleotidprimern für drei ISRGenospeziesvon A. phocae (ISR-Gruppe I bis III) und für sechs weitere Spezies der GeneraArcanobacterium bzw. Trueperella. Dies ermöglichte eine PCR-vermittelte Identifizierungder jeweiligen ISR-Genospezies bzw. Spezies. A. phocae-ISR-Gruppe I konnte im weiterendurch ein A. phocae-sodA-spezifisches Oligonukleotidprimerpaar und durch das PhocaelysinkodierendeGen phl, die A. haemolyticum-Kulturen durch das Phospholipase D-kodierendeGen pld und die A. (T.) pyogenes-Kulturen durch das Pyolysin-kodierende Gen ploweitergehend charakterisiert werden. Das Phocaelysin-kodierende-Gen phl von A. phocaestellt, vergleichbar mit dem Pyolysin-kodierenden-Gen plo von A. (T.) pyogenes, das Geneines bisher noch nicht beschriebenen porenbildenden Toxins von A. phocae dar.Die Charakterisierung von drei ISR-Genospezies von A. phocae korrelierte mit dem Nachweisdes Phocaelysin-kodierenden Gens phl (ISR-Gruppe-I) und mit einigen kulturellen undbiochemischen Merkmalen der Kulturen. Die Bedeutung dieser Unterschiede für dietaxonomische Einordnung von A. phocae ist bislang allerdings noch unklar.Die phänotypische und genotypische Identifizierung der bisher nur als humanpathogenbekannten Spezies A. haemolyticum, isoliert von Pferden, einer A. pluranimalium-Kultur,isoliert von einem Hund, und auch der A. (T.) pyogenes-Kulturen, isoliert von einerBartagame und einem Gecko, gelang erstmalig bei den jeweiligen Tierarten. Die Isolierungder unterschiedlichen Spezies der Genera Arcanobacterium bzw. Trueperella dervorliegenden Untersuchungen erfolgte in der Regel mit zahlreichen weiterenMikroorganismen unterschiedlicher Spezies, sodass, mit Ausnahme für die A. (T.) pyogenes-Kulturen, isoliert von Rindermastitiden, über die Bedeutung der Arcanobacterium- bzw.Trueperella-Kulturen für das jeweilige Krankheitsbild keine abschließende Aussage getroffenwerden kann.Die in den vorliegenden Untersuchungen aufgeführten konventionellen und molekularenVerfahren könnten die diagnostische Erkennung von Bakterien der Genera Arcanobacteriumbzw. Trueperella in klinischem Untersuchungsmaterial verbessern helfen und darüber hinaus,zur Klärung der Bedeutung dieser Bakterien bei Infektionen von Tier und Mensch beitragen. In the present study 11 reference cultures of nine species of genera Arcanobacterium orTrueperella, 43 A. phocae cultures, isolated from harbour seals and one grey seal, seven A.haemolyticum-cultures, isolated from horses, one A. pluranimalium culture, isolated from adog, three A. (T.) bialowiezense and seven A. (T.) bonasi cultures, isolated from the Europeanbison, two A. (T.) pyogenes cultures, isolated from a bearded dragon and a gecko, and 26 A.(T.) pyogenes cultures, isolated from mastitic cows, could be phenotypically andgenotypically identified and further characterized.All Arcanobacterium or Trueperella cultures of the present study could be identified bycultural properties, their hemolysis, by detection of synergistic and antagonistic hemolyticreactions and by determination of biochemical properties. A molecular characterization of theArcanobacterium or Trueperella cultures was realized by 16S rDNA-analyses and, with geneor genome parts which had not been investigated for these genera, by sequencing of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region (ISR), the 23S rDNA, the superoxide dismutase Aencoding gene sodA and the beta subunit of RNA polymerase encoding gene rpoB. Theresults of ISR, 16S rDNA and 23S rDNA sequencing allowed the design of specificoligonucleotide primers for three ISR-genospecies of A. phocae (ISR group I toIII) and for sixadditional species of genera Arcanobacterium or Trueperella. This allowed a PCR-mediatedidentification of the respective ISR-genospecies or species. The A. phocae ISR group I couldbe further characterized by using an A. phocae sodA specific oligonucleotide primerpair andby amplification of the phocaelysin encoding gene phl, the A. haemolyticum cultures byamplification of phospholipase D encoding gene pld and the A. (T.) pyogenes cultures byamplification of pyolysin encoding gene plo. The phocaelysin encoding gene phl of A. phocaerepresents, comparable to the pyolysin encoding gene plo of A. (T.) pyogenes, a gene of a poreforming toxin of A. phocae which has not yet been described.The occurrence of three genospecies of A. phocae correlated with the detection of phocaelysinencoding gene phl (ISR group I) and some cultural and biochemical characteristics of thecultures, although their significance for the taxonomic position of A. phocae remains unclear.The phenotypic and genotypic identification of the species A. haemolyticum from horses, aspecies which has been regarded so far as a human pathogen, the A. pluranimalium culture,isolated from a dog, and the A. (T.) pyogenes species, isolated from a bearded dragon and agecko, could for the first time be approved for the respective animal species. The isolation of150the different species of genera Arcanobacterium or Trueperella of the present study usuallyoccurred with a number of various other microorganisms of different bacterial species.Consequently, with the exception of the A. (T.) pyogenes cultures, isolated from bovinemastitis, no final statement about the importance of the Arcanobacterium or Trueperellacultures for the respective disease could be made.However, the conventional and molecular techniques which are described in the present studycould contribute to improve the diagnostic detection of bacteria of genera Arcanobacterium orTrueperella and to clarify the significance of these bacteria in animal and human infections.