Rolle des NO/cGMP-Signalweges bei der Regulation des kontraktilen Apparates von porcinen Endothelzellen

Abstract

Der kontraktile Apparat spielt eine wesentliche Rolle bei der Regulation der endothelialen Schrankenfuntion. Die Aktivierung des kontraktilen Apparates wird dabei durch den Phosphorylierungsgrad der kleinen regulatorischen Untereinheiten des Myosins bestimmt. Dieser wiederum unterliegt der Kontrolle zweier Enzyme des kontraktilen Apparates: Myosinleichtkettenphosphatase (MLKPase) und MLK-Kinase (MLKK). Manöver, die die Konzentration des intrazellulären Botenstoffes NO/cGMP steigern, stabilisieren die endotheliale Schrankenfunktion. Der Mechanismus dieser schrankenprotektiven Wirkung wird bisher nur teilweise verstanden. In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob NO/cGMP den kontraktilen Apparat der Endothelzellen beeinflusst und damit die Schranke stabilisiert. Im Zentrum stand dabei die Regulation der MLK-Kinase und MLK-Phosphatase.Die Experimente wurden an kultivierten porcinen Aortenendothelzellen durchgeführt. Dabei wurde der Phosphorylierungsgrad der MLK unter Einfluss verschiedener enzymatischer Aktivatoren bzw. Inhibitoren bestimmt. Des Weiteren wurden die Permeabilität und die kontraktile Aktivierung der Endothelzellschichten über deren Albumindurchlässigkeit sowie isometrische Kraftentwicklung gemessen. Zusätzlich wurde die Translokation der katalytischen Untereinheit, PP1, an Myosin dargestellt, und die zytosolische Ca2+-Konzentration mittels eines fluoreszierenden Ca2+-Indikators bestimmt.Die Zugabe des NO-Donors DEA-NONOate (50 µM) verursachte sowohl eine starke Abnahme der MLK-Phosphorylierung, als auch eine deutliche Abnahme der isometrischen Kraft und Permeabilität der Endothelzellen. In Gegenwart des PKG-Inhibitors RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM) wurden sämtliche NO/cGMP-Effekte auf die untersuchten Parameter wieder aufgehoben. YC-1 (20 µM), ein Aktivator der löslichen Guanylyzyklase sowie Sp-8-Br-PET-cGMPS (50 µM), ein direkter Aktivator der PKG, zeigten analoge Wirkungen wie DEA-NONOate, die unter Einfluss von RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM) ebenfalls wieder aufgehoben wurden. Bei vollständiger pharmakologischer Hemmung der MLK-Kinase durch ML-7 (50 µM) verstärkte NO/cGMP die Wirkung von ML-7 auf die MLK-Phosphorylierung. Im Gegensatz dazu wurde durch vollständige pharmakologische Hemmung der MLK-Phosphatase durch Calyculin A (10 nM) die dephosphorylierende Wirkung von NO/cGMP aufgehoben. Dies spricht dafür, dass NO/cGMP über Aktivierung der MLK-Phosphatase und nicht über Hemmung der MLK-Kinase die MLK-Phosphorylierung reduziert. In Übereinstimmung damit konnte gezeigt werden, dass DEA-NONOate eine Translokation der PP1-Untereinheit an Myosin induziert. Die zytosolische Ca2+-Konzentration änderte sich unter NO/cGMP-Einfluss nicht.In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass NO/cGMP in aortalen Endothelzellen die MLK-Phosphatase aktiviert. Die Aktivierung erfolgt über einen NO/cGMP/PKG-abhängigen Mechanismus und bewirkt eine Translokation der PP1 an Myosin. Die resultierende Dephosphorylierung der MLK führt zu einer Hemmung des endothelialen kontraktilen Apparates und schließlich zu einer Abnahme sowohl der isometrischen Kraftentwicklung als auch der Permeabilität des Endothels. Dieser Prozess ist Ca2+-unabhängig. The contractile machinery plays an important role in the regulation of the endothelial barrier function. The activation state of the contractile machinery is determined by the phosphorylation of the small regulatory subunit of myosin. This level, in turn, is controlled by two enzymes of the contractile apparatus: myosin light chain (MLC) phosphatase and MLC kinase. Manoeuvres that increase the concentration of the intracellular messenger NO/cGMP are able to stabilize the endothelial barrier function. The mechanism of this barrier protective effect is only partially understood. In this study we analyzed whether NO/cGMP influences the contractile machinery of the endothelial cells and therefore stabilizes the barrier function. As the central aim the regulation of the MLC kinase and the MLC phosphatase was investigated.Experiments were performed in cultured monolayer of porcine aortic endothelial cells. MLC phosphorylation was analyzed by the influence of different enzymatic activators or inhibitors, respectively. Furthermore, the permeability and the contractile activation of the endothelial monolayer were measured by determining its albumin permeability and developement of isometric force. In addition, translocation of the catalytic subunit, PP1, to myosin was analysed. The cytolsolic Ca2+ concentration was determined by fluorescent Ca2+ indicator technique.Application of the NO donor DEA-NONOate (50 µM) caused a strong decline in MLC phosphorylation as well as a distinct reduction of macromolecule permeability and isometric force. In presence of the PKG Inhibitor RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM) the effects of DEA-NONOate on all parameters were completely blocked. YC-1 (20 µM), activator of the soluble guanylyl cyclase, and Sp-8-Br-PET-cGMPS (50 µM), activator of PKG, had the same effects as DEA-NONOate. All DEA-NONOate effects were completely blocked by RP-8-pCPT-cGMPS (50 µM). Under conditions of complete pharmacological inhibition of the MLC kinase by ML-7 (50 µM), NO/cGMP still enhanced MLC dephosphorylation. In contrast, the NO/cGMP-induced dephosphorylation of MLC was abolished if MLC phosphatase was completely inhibited by calyculin A. These data suggest that NO/cGMP reduces MLC phosphorylation by activating the MLC phosphatase but not by inhibition of the MLC kinase. Accordingly, DEA-NONOate induces translocation of PP1 to myosin. However, the cytosolic Ca2+ concentration was not affected by NO/cGMP. This study shows for the first time, that NO/cGMP activates the MLC phosphatase in aortic endothelial cells. The activation of PP1 is mediated by a cGMP/PKG-dependent mechanism and causes translocation of PP1 to myosin. The resulting dephosphorylation of MLC leads to inactivation of the endothelial contractile machinery and finally reduces isometric force and permeability. This process is independent of Ca2+.