Entwicklung und Prüfung eines Impfstoffes gegen die Ödemkrankheit der Schweine

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Toxoidimpfstoffe gegen die Ödemkrankheit derSchweine auf der Basis von rekombinantem Shigatoxin vom Typ 2e (rStx2e) zu entwickelnund ihre Wirksamkeit an Ferkeln zu prüfen.Die Stx2e-Gene stxA2e und stxB2e des E. coli-Stammes 412 wurden in den PlasmidvektorpET-24b(+) inseriert und in kompetenten E. coli BLR(DE3)-Zellen kloniert. Die Identität allerrStx2e-Transformanten bzw. die ordnungsgemäße Klonierung und Expression der Stx2e-Gene wurde mit Hilfe von PCR, Sequenzierung, Tricine-SDS-PAGE, Immunoblot und Verozell-Zytotoxizitätstest überprüft. Für die Wirksamkeitsprüfung von Impfstoffen wurde einstandardisiertes und kontrolliertes Ödemkrankheitsmodell etabliert, bei dem rStx2eintravenös an sechs Wochen alte Ferkel verabreicht wurde. In Abhängigkeit von der Dosistraten nach wenigen Stunden typische Symptome der Ödemkrankheit auf (Unterhautschwellungenan Augenlidern und Nasenrücken, Ataxien, Krämpfe, Festliegen, Ruderbewegungen,Todesfälle). In Anlehnung an die Europäische Pharmakopöe wurde die Belastungsdosisauf 750.000 CD50 pro Ferkel eingestellt (mind. 40 % Mortalität und 85 % Morbidität).Zur Verwendung als Impfantigen wurde rStx2e chemisch inaktiviert, indem es mit GlutaroderFormaldehyd behandelt wurde (rStx2eGA und rStx2eFA). In einem alternativen Ansatzwurden auf gentechnischem Wege rStx2e-Varianten erzeugt, in denen eine, zwei oder dreibestimmte Aminosäuren in der A-Untereinheit des Toxins (E167Q, R170L, A216D)substituiert worden waren. Die Aldehydbehandlungen reduzierten die toxische Aktivität desrStx2e gegenüber Verozellen um den Faktor 1.000 - 2.000, verminderten aber auch dieErkennung des Antigens durch Antikörper im ELISA. Die gentechnisch hergestellte VarianterStx2eE167QR170L war um den Faktor 132.278 weniger toxisch als unverändertes rStx2e. Diegenetisch veränderten rStx2e-Varianten wurden von den entsprechenden E. coli BLR(DE3)-Stämmen stärker exprimiert als unverändertes Stx2e.Zur Überprüfung ihrer Immunogenität wurden die rStx2e-Impfantigene mit verschiedenenAdjuvantien (Aluminiumhydroxid, Montanide) vermischt und an den Lebenstagen 9 und 28intramuskulär an Saugferkel verimpft. Placebo-geimpfte und nicht geimpfte Ferkel dientenals Kontrollen. Einige Tage nach dem Absetzen (Lebenstag 37 oder 38) wurden alle Ferkelintravenös mit rStx2e belastet. Vor und nach der Impfung sowie nach der Belastung wurdenSerumproben genommen und auf E. coli-spezifische Antikörper (ELISArStx2e) sowie rStx2eneutralisierendeAntikörper (Stx2e-Neutralisationstest) untersucht.Alle getesteten Toxoidimpfstoffe wirkten protektiv, was sich an der im Vergleich zur Kontrollgruppegeringeren Mortalität in den Impfgruppen äußerte. Von dem mit rStx2eGA-Antigengeimpften Ferkeln (Antigendosis & #8805; 750.000 CD50-Äquivalente) überlebten 98 % die rStx2e-Belastung. Bei Impfung mit 150.000 CD50-Äquivalenten überlebten noch 83,4 %, bei15.000 CD50-Äquivalenten nur 28,6 %. Mit einer Dosis von 1.500 CD50-Äquivalenten war keinFerkel zu schützen. Von den Ferkeln, die mit Toxoidimpfstoffen auf Basis von rStx2eE167QR170Lgeimpft worden waren, überlebten 82 % die rStx2e-Belastung, wobei die Mortalitäten in deneinzelnen Gruppen je nach eingesetztem Adjuvans deutlich differierten. So überlebten beiVerwendung der Montanide IMS1313 und IMS251C alle Ferkel, dagegen bei Aluminiumhydroxidnur 60 % der Ferkel.Nach der ersten Immunisierung waren Stx2e-neutralisierende Antikörper nur bei drei(rStx2eGA) der insgesamt 160 mit rStx2eGA- bzw. rStx2eE167QR170L-Toxoidvakzinen geimpftenFerkel (1,9 %) nachweisbar, nach der zweiten Immunisierung dagegen bei 80 % der Ferkel.Bei 92 % der geimpften Ferkel, welche die rStx2e-Belastung überlebten, waren vor derBelastung Stx2e-neutralisierende Antikörper vorhanden gewesen. Alle Ferkel mit einem Titervon >= 10 StdNT % überlebten die rStx2e-Belastung. Die höchsten Titer an Stx2e-neutralisierendenAntikörpern wurden mit dem rStx2eGA-Impfstoff in einer Antigendosis von1,5 oder 0,75 Mio CD50-Äquivalenten sowie dem rStx2eE167QR170L-Impfstoff in Kombination mitIMS1313 und IMS251C als Adjuvans erzielt. Bei den Kontrollferkeln waren Stx2eneutralisierendeAntikörper vor der rStx2e-Belastung in keinem einzigen Fall nachweisbar.Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass sowohl die chemisch als auch die gentechnischinaktivierten rStx2e-Impfantigene im Ferkel eine sehr gute immunogene und protektiveWirkung haben und sich daher zur Herstellung von Toxoidvakzinen gegen dieÖdemkrankheit eignen. Um eine hohe Schutzwirkung zu erzielen, ist eine zweimaligeImmunisierung mit einer minimalen Impfantigendosis von jeweils 750.000 CD50-Äquivalenten(rStx2eGA-Antigen) bzw. 15.750 OD50 (rStx2eE167QR170L-Antigen) erforderlich. Das Ödemkrankheitsmodell ist zur Wirksamkeitsprüfung von Stx2e-Toxoidimpfstoffen sehr gut geeignet, es ist aber auch aufwändig und mit Leiden für die Tiere verbunden. Die Quantifizierung von Stx2e-neutralisierenden Antikörpern kann entsprechende Versuche zumindest in einigen Fällen ersetzen. The objective of the present study was the development and evaluation of toxoid vaccinesbased on recombinant Shigatoxin 2e (rStx2e) in order to immunize piglets against edemadisease.The Stx2e genes stxA2e and stxB2e of E. coli strain 412 were transferred into the plasmidpET-24b(+) by recombinant DNA technologies and cloned into competent cells of E. colistrain BLR(DE3). The identity of all rStx2e transformants and the correct cloning andexpression of the Stx2e genes were confirmed by PCR, DNA sequencing, Tricine-SDSPAGE,immunoblot analysis and a vero cell cytotoxicity assay. In order to test Stx2e-toxoidvaccines for their efficacy a standardized and controlled edema disease model wasestablished where rStx2e was administered intravenously to piglets at six weeks of age.Dependent on the amount of rStx2e administered typical signs of edema disease occurredwithin a few hours (subcutaneous swelling of eyelids and nosebridges, staggering gaits,paddling, spasms and ataxia). According to the European Pharmacopoeia the rStx2echallenge dose to be used in immunization trials was defined as 750.000 CD50 per piglet(minimum mortality and morbidity in the control group: 40 % and 85 %, respectively).Prior to its use as an antigen in vaccines, rStx2e was chemically inactivated by treatmentwith glutaraldehyde or formaldehyde (rStx2eGA und rStx2eFA). In an alternative approachgenetic engineering was used to generate variants of rStx2e which carried one, two or threeamino acid substitutions at defined residues in the A-subunit of Stx2e (E167Q, R170L,A216D). Treatment with glutaraldehyde or formaldehyde reduced the cytotoxicity of rStx2etowards Vero cells by a factor of 1000 to 2000. However, this treatment also impaired thedetectability of rStx2e by antibodies in an ELISA. The variant rStx2eE167QR170L was 132.278times less toxic than non-modified rStx2e. In addition, both modified rStx2e variants wereproduced at higher rates than non-modified rStx2e by their respective E. coli strains.In order to prove their immunogenicity rStx2e antigens were mixed with various adjuvants(aluminium hydroxide, montanides) and administered intramuscularly to suckling piglets atdays 9 and 28 of life. Non-vaccinated piglets and piglets vaccinated with a placebo served ascontrols. A few days after weaning (day 37 or 38) each piglet was challenged intravenouslywith rStx2e. Prior to and after vaccination as well as after the challenge blood samples werecollected and tested for E. coli specific (ELISArStx2e) and Stx2e-neutralizing antibodies (Stx2e-neutralization assay).All tested rStx2e-toxoid vaccines proved protective which manifested itself as a reducedmortality in groups of vaccinated piglets compared to the controls. Piglets survived the rStx2echallenge at 98 %, if they had been vaccinated with rStx2eGA (antigen dose ≥ 750.000 CD50equivalents). Vaccination with doses of 150.000 and 15.000 CD50 equivalents resulted inconsiderable less survivors (83.4 % and 28.6 %, respectively). No protection was achievedby immunization with a dose of 1.500 CD50 equivalents. Among all piglets vaccinated withrStx2eE167QR170L 82 % were able to survive the rStx2e challenge. However, the mortalities inthe groups varied considerably depending on the type of adjuvant employed. In cases wheremontanides IMS1313 and IMS251C were used all piglets survived, while only 60 % of thepiglets survived when vaccines had been supplemented with aluminium hydroxyde.Stx2e neutralizing antibodies were detected only in three (rStx2eGA) of 160 piglets (1.9 %)after the first shot of the rStx2eGA- or rStx2eE167QR170L-toxoid vaccines, respectively. However,80 % proved positive after the second shot. In 92 % of the immunized piglets which survivedthe rStx2e challenge Stx2e-neutralizing antibodies had been present prior to the challenge.All piglets with a titer of ≥ 10 StdNT % survived the challenge. Administration of the rStx2eGAvaccine(antigen doses of 1.5 or 0.75 Mio CD50 equivalents) or the rStx2eE167QR170L-vaccinesupplemented with IMS1313 or IMS251C yielded the highest titres of Stx2e-neutralizingantibodies. None of the control piglets showed Stx2e neutralizing antibodies prior to theexposure to rStx2e.Results suggest that both chemically as well as genetically inactivated rStx2e represent veryvaluable immunogenic and protective antigens for the production of toxoid vaccines againstedema disease. In order to achieve highest degrees of protection it appears essential tovaccinate piglets twice with a minimal dose of 750.000 CD50 equivalents (antigen rStx2eGA)or 15.750 OD50 (antigen rStx2eE167QR170L), respectively, at each time point. The edemadisease model is a valuable tool to assess the efficacy of Stx2e-toxoid vaccines. However,this model is laborious and may raise objections due to ethical aspects. At least in somecases it can be replaced by the assessment of Stx2e-neutralizing antibodies in bloodsamples.