Untersuchungen zu Plastizität und Funktion des KSPV Core-Proteins

Abstract

Das KSPV Core-Protein bildet zusammen mit dem viralen Genom das Nukleokapsiddes Viruspartikels. Seine Plastizität wurde durch gezielte Verkleinerung undVergrößerung der Core-kodierenden Region untersucht.1) Deletionen der Core-Aminosäuren (AS) 179-180,194-198, 208-212 oder 254-255wirken sich stark negativ auf die Bildung von Viruspartikeln aus. Große Bereichebasischer AS (213-231) können ohne starke Reduktion der Virusproduktion entferntwerden.2) Eine Vergrößerung des Core-Proteins durch Duplikation oder Triplikation desCore-Gens sowie durch das Einfügen von ein bis drei YFP-Genen zwischen zweiCore-Genen ist möglich. Dabei werden die vergrößerten Proteine in die gebildetenViruspartikel integriert.3) Die korrekte räumliche Anordnung von Core-Domänen ist für die Funktion desProteins essentiell.4) Der Aminosäureaustausch Asparagin 2256 zu Tyrosin in der NS3-Helikase-Domäne steigert die Virusbildung eines subvitalen KSPV, das für YFP-Core kodiert,um mehr als das Hundertfache.Von der Partikelbildung unabhängige Core-Funktionen sollten durch dieCharakterisierung eines Core-Deletions-KSPV (Vp1017) untersucht werden.1) Das Vp1017 ist auf primären porzinen Zellen nicht vermehrungsfähig. PorzineZelllinien mit aktiviertem IFN-System zeigen eine stark verminderte Empfänglichkeitfür das Vp1017 und eine Reduktion der Virusproduktion.2) Das Vp1017 besitzt ein nicht funktionelles Npro. Es erfolgt keine Abspaltung vomviralen Polyprotein und somit auch keine Antagonisierung von IRF-3. Die Insertionvon fünf AS an der Npro-Core Spaltstelle ist ausreichend, um die Funktionalität vonNpro wiederherzustellen (VpCR85).3) Die Empfänglichkeit von porzinen Zelllinien mit aktiviertem IFN-System für dasVpCR85 ist deutlich herabgesetzt. Diese Reduktion der Empfänglichkeit kann durchdas Vorhandensein von Core im Viruspartikel, in Abhängigkeit von der Menge,teilweise bis gänzlich aufgehoben werden. The CSFV nucleocapsid consists of the viral RNA genome and the Core-Protein. Itsplasticity was examined by diminuition and multitplication of the Core coding regionand by insertion of nonviral sequences between a Core dimer.1) Deletion of Core amino acids (aa) 179-180, 194-198, 208-212 or 254-255 stronglydecreases virus formation. Large stretchtes of predominantly basic aa (213-233) canbe deleted without a significant reduction of virus production.2) The enlargment of the CSFV Core-Protein by duplicating or triplicating the Corecoding region, as well as the insertion of one three YFP genes between a Coreduplicate still allow for the generation of virus. These modified proteins are integratedinto the viral particles.3) Correct spatial arrangement of Core domains is essential for function.4) Virus output of a subvital CSFV encoding for YFP-Core increases more than 100-fold if asparagin 2256 is exchanged to tyrosin.A Core deletion CSFV (Vp1017) was employed to study assembly independent Corefunctions.1) Vp1017 is nonviable in primary porcine cells. The susceptibility of porcine cell lineswith an activated IFN-system for Vp1017 is strongly reduced. Additionally, virusproduction is decreased.2) The Npro of Vp1017 is non-functional due to lack of cleavage from the polyproteinand inability to antagonize IRF3. An insertion of five amino acids at the Npro-Corecleavage site (VpCR85) is sufficient to restore Npro function.3) Porcine cell lines with an activated IFN-system exhibit a strong decline ofsusceptibility for VpCR85. This loss of susceptibility is counteracted by presence ofCore in the virus particles, the effect being dependent upon the amount of Core thatis integrated into the particles.