Nachweis von Ranavirusinfektionen bei Landschildkröten und Charakterisierung von Virusisolaten

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Erkrankungen nach einer Infektion mit Ranavirus bei Landschildkröten aus acht verschiedenen Beständen in Deutschland untersucht. Acht Virusisolate aus diesen Beständen wurden eingehend analysiert. Zum Vergleich wurden zwei Ranavirusisolate aus Amphibien mitgeführt. Die Bestätigung dieser zehn Isolate als Angehörige des Genus Ranavirus erfolgte mittels Chloroform- und IUDR-Test, der Ranavirus-spezifischen PCR sowie des Ranavirus-typischen cpE in der TH-1-Zellkultur. Die Vermehrung der zehn Isolate wurde in verschiedenen Zellkulturen bei 28 °C und 37 °C untersucht. Alle Isolate vermehrten sich bei einer Inkubationstemperatur von 28 °C, jedoch nicht bei 37 °C. Am stärksten vermehrten sich die Isolate in der TH-1-Zellkultur, so dass eine Inkubation bei 28 °C auf TH-1-Zellen als Methode der Wahl zur Isolierung von Ranavirus in Zellkulturen zu empfehlen ist. Bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C zeigten sich in einigen Zelllinien zytopathische Veränderungen, eine Virusvermehrung war aber nicht nachweisbar. Der cpE wurde in diesen Zellkulturen vermutlich durch einen toxischen Effekt der Ranaviren hervorgerufen.Nach der Spaltung des gesamten Genoms mit den Enzymen EcoRI, HindIII, XbaI und KpnI sowie bei der Sequenzanalyse eines Teils des MCP-Gens zeigte sich, dass die acht Ranavirusisolate aus Schildkröten untereinander identisch bzw. sehr nahe verwandt sind. Die beiden Ranavirusisolate aus Amphibien wiesen bei der Restriktionsenzymanalyse eine maximale Übereinstimmung von 33,3 % zu den Ranavirusisolaten aus Schildkröten auf, so dass die von mir untersuchten Isolate aus Schildkröten nach der Definition von CHINCHAR et al. (2005) einen eigenen phylogenetischen Virusstamm bilden. Auch der Vergleich dieser Schildkrötenisolate mit in den DNA-Sequenzdatenbanken hinterlegten Sequenzen anderer Ranaviren ergab keine nahe Verwandtschaft, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die bisher aufgetretenen Erkrankungsfälle in Deutschland von einem einzigen, bisher nicht in den DNA-Sequenzdatenbanken hinterlegten Ranavirus hervorgerufen wurden.Die bestehenden Methoden zum Nachweis von Ranaviren wurden überprüft. Es zeigte sich, dass der Nachweis von Ranavirus mittels PCR deutlich häufiger gelang als mittels Zellkultur. Von den 400 untersuchten Organ- und Tupferproben waren 133 positiv in der PCR und nur 10 positiv in der TH-1-Zellkultur. Bei Verwendung eines Membranfilters mit einer mittleren Porenweite von 0,45 um statt 0,2 um zum Filtrieren der Probensuspensionen vor Inokulation der TH-1-Zellkultur ließ sich aus 2 von 38 vorher nur in der PCR positiven Tupferproben Ranavirus in der TH-1-Zellkultur isolieren.Bei epidemiologischen Untersuchungen gelang der Virusnachweis mittels PCR in Rachentupferproben ehemals erkrankter Schildkröten bis zu acht Wochen länger als in Kloakentupferproben. Bis zu sieben Wochen nach der Genesung von einer spontanen Infektion ließen sich Teile des Ranavirusgenoms in Rachentupferproben nachweisen. Es konnte nicht bewiesen werden, dass nachgewiesene Teile des Ranavirusgenoms immer von vermehrungsfähigem Virus stammen. In einigen Fällen konnte jedoch vermehrungsfähiges Virus isoliert werden bzw. schien aufgrund des Krankheitsverlaufs das Vorliegen von vermehrungsfähigem Virus sehr wahrscheinlich. Bisher bestand in Europa keine Möglichkeit zum Nachweis von Ranavirus-spezifischen Antikörpern im Serum oder Blutplasma von Schildkröten. Aus diesem Grund war es ein weiterer wichtiger Teil meiner Arbeit, ein geeignetes Testverfahrens zum Antikörpernachweis zu etablieren. Mittels klassischen Neutralisationstests in TH-1-Zellkulturen ließen sich keine neutralisierenden Antikörper nachweisen. Daher wurde von mir ein ELISA zum Antikörpernachweis entwickelt und auf Spezifität und Sensitivität überprüft. 227 Seren von erkrankten, genesenen und unverdächtigen Schildkröten wurden mit diesem ELISA auf das Vorhandensein von Ranavirus-spezifischen Antikörpern untersucht. Bei allen genesenen Schildkröten ließen sich Antikörper nachweisen. Alle Schildkröten ohne bekannte Ranavirusinfektion wiesen keine Antikörper auf.Es wurden Untersuchungen zum Verlauf der Antikörpertiter durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass die Antikörpertiter über den untersuchten Zeitraum (bis zu zwei Jahren) stetig anstiegen. Die Dauer bis zum Beginn der Bildung nachweisbarer Antikörper sowie die Höhe der Antikörpertiter scheinen von der Schwere der vorausgehenden Erkrankung abhängig zu sein. Schildkröten, die schwere Krankheitssymptome gezeigt hatten, wiesen früher höhere Antikörpertiter auf als Schildkröten, die nur leicht erkrankt waren.