Mechanismen der Postconditioning-vermittelten Protektion gegen den endothelialen Reperfusionsschaden

Abstract

Die Hauptaufgabe der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob die Anwendung ischämischer und pharmakologischer Postkonditionierung isolierte koronare Rattenendothelien vor reperfusionsinduzierter interzellulärer Lückenbildung schützen kann.Es wurden simulierte Ischämie- und Reperfusionsversuche durchgeführt. Nach einer 5-minütigen normoxischen Vorlaufphase wurden Endothelzellen 40 Minuten lang mit einer anoxischen HEPES-gepufferten Tyrodelösung (pH 6,4, glukosefrei) perfundiert. In der anschließenden 40-minütigen Reoxygenation wurden die Zellen mit einem normoxischen Medium (pH 7,4) unter Zugabe von 5mM Glukose superfundiert.Es wurden verschiedene Protokolle der ischämischen Postkonditionierung entwickelt, um ihre Auswirkungen auf die reperfusionsinduzierte Lückenbildung und die intrazelluläre Kalziumkonzentration zu untersuchen. Die Anwendung der ischämischen Postkonditionierungsprotokolle 5x(30+30) und 10x(30+30) schützen Endothelzellen signifikant vor reperfusionsinduzierter Lückenbildung. Dieser protektive Effekt hat keine Auswirkungen auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration und lässt sich auch nicht durch extrazelluläre pH-Wert-Schwankungen in der Reperfusion erzielen. Durch den Einsatz des spezifischen PI3-Kinase-Inhibitors Ly294002, als eine der beteiligten RISK bei der Postkonditionierung, konnte der Schutz vor reperfusionsinduzierter interzellulärer Lückenbildung in den protektiven Protokollen 5x(30+30)+Ly und 10x(30+30)+Ly aufgehoben werden. Die Aktivierung der PI3K, als ein Schritt der RISK-Signalkaskade, ist bei der Postkonditionierung an koronaren Rattenendothelien essentiell beteiligt. In einer weiteren Versuchsreihe wurde der Einfluss von Cannabinoiden auf die reperfusionsinduzierte Lückenbildung und die intrazelluläre Kalziumkonzentration an koronaren Endothelzellmonolayern untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass der Einsatz von R1M, einem Cannabinoidrezeptoragonisten, die reperfusionsinduzierte Lückenbildung an Endothelzellen signifikant reduziert. Dieser protektive Effekt beruhte auf der Aktivierung des CB1R und hat keinen Einfluss auf die intrazelluläre Kalziumkonzentration.Die Inhibition der NOS führte weitestgehend zu einer Aufhebung der R1M-vermittelten Protektion vor reperfusionsinduzierter Lückenbildung. Die Applikation des PKG-Inhibitors KT5823 hatte keinen blockierenden Effekt auf den R1M-vermittelten Schutz vor endothelialer Permeabilitätserhöhung.Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Anzahl nekrotischer Zellen in den Versuchen mit R1M signifikant reduziert werden konnte. Diese Schutzwirkung wird über eine NOS-Aktivierung vermittelt, da gezeigt werden konnte, dass die Protektion gegen den endothelialen Reperfusionsschaden durch den NOS-Inhibitor L-NAME aufgehoben wurde. Somit lässt sich feststellen, dass die Aktivierung der NOS durch R1M bei der pharmakologischen Postkonditionierung an koronaren Endothelmonolayern ein essentieller Faktor ist. The aim of the present study was to investigate whether the application of ischemic and pharmacological postconditioning protects isolated coronary endothelial cells from rats against the formation of intercellular gaps.Therefore, simulated ischemia and reperfusion experiments were performed. After a five minute normoxic phase, the endothelial cells were perfused with an anoxic HEPES-buffered-Solution (pH 6.4, glucose-free) for 40 minutes. During the following 40 minutes the cells were reoxygenated with a normoxic medium (pH 7.4 + 5 mM glucose). Several experimental protocols of ischemic postconditioning were developed to investigate the influence on the reperfusion induced gap formation and the intracellular Ca2+-concentration. The ischemic postconditioning protocols "5x(30+30)" and "10x(30+30)" protect endothelial cells significantly against the formation of intercellular gaps. This protective effect does not influence the intracellular Ca2+-concentration and cannot be achieved by extracellular pH variations during reperfusion. Application of the specific PI3-kinase inhibitor Ly294002, as one of the participating RISK in postconditioning, abrogated the protective effect against intercellular gaps in the protocols "5x(30+30)+Ly" and "10x(30+30)+Ly". The activation of PI3K, as a step of RISK signaling cascade, is of essential interest in postconditioning of coronary endotheliumIn another series of experiments, the influence of cannabinoids on the reperfusion induced formation of intercellular gaps and the intracellular Ca2+-concentration in coronary endothelial monolayer was investigated. It was shown that the application of R1M, a cannabinoid receptor agonist, significantly reduced intercellular gaps between endothelial cells. This protective effect of R1M is based upon the activation of CB1R and has no effect on the intracellular Ca2+-concentration. The inhibition of NOS abrogated almost completely the protective effect of R1M-mediated protection against reperfusion induced gap formation. The application of the PKG-Inhibitor KT5823 had no blocking effect on the R1M-mediated protection against the increase of endothelial permeability. Furthermore, R1M significantly reduced the number of necrotic cells. This protective effect is mediated through NOS-activation since the protection against endothelial reperfusion injury could be abrogated by inhibition of NOS with the inhibitor L-NAME. Thus, it can be concluded that the activation of NOS by R1M for pharmacological postconditioning on coronary endothelial monolayers is a necessary factor.