Quantifizierung IL-4- und IFN-gamma-bildender Lymphozyten im peripheren Blut zur Diagnostik einer TH1/TH2-Imbalance beim Pferd

Abstract

Das TH1/TH2-Gleichgewicht ist entscheidend an der Entwicklung einer adäquaten Immunantwort beteiligt. Eine Störung dieses Gleichgewichts ist auch beim Pferd mit der Genese von Erkrankungen wie z. B. dem Sommerekzem verbunden, dessen sympto¬matische Phase von einer überschießenden TH2-Immunantwort begleitet wird. Die Vermutung, dass auch die Chronisch Obstruktive Bronchitis (COB) des Pferdes auf einer vermehrten Bildung von TH2-Zytokinen beruht, wird kontrovers diskutiert. Die Aufklärung der Pathogenese dieser bedeutenden Pferdekrankheit wird dadurch erschwert, dass bislang ein einheitlich einsetzbares System zur Bestimmung des TH1/TH2-Gleichgewichts fehlt.Die vorliegende Arbeit folgte der Hypothese, dass es durch In vitro-Provokation equiner Lymphozyten mit verschiedenen Noxen und anschließender durchflusszytometrischer Quantifizierung von Zytokin-bildenden T-Zellpopulationen möglich ist, eine möglichst genaue Aussage über das individuelle TH1/TH2-Verhältnis und damit über die Immunlage von Pferden anhand einer Blutprobe treffen zu können. Als Noxen fanden neben den Mykotoxinen Gliotoxin und Patulin auch LPS und Dexamethason Anwendung. Jede einzelne Noxe wurde als Prototyp für potentiell immun¬modulatorisch wirkende, exogene Einflussfaktoren auf das equine Immunsystem ausgewählt. Mittels Dichtezentrifugation (Ficoll-Paque®) isolierte, periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden mit den jeweilig eingesetzten Noxen für 20 Stunden und für weitere vier Stunden zusätzlich mit Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA), Ionomycin und Bre¬feldin A inkubiert. Danach erfolgte die durchflusszytometrische Quantifizierung von CD4+/IFN-γ+- (TH1-) und von IL-4+- (TH2-) Zellen, deren Anteile die Grundlage für die Berechnung des TH1/TH2-Verhältnisses bildeten. In Vorversuchen an drei klinisch gesunden, adulten Pferden wurden zunächst Konzentrationsbereiche ermittelt, in denen Noxen-spezifische, immun¬modulatorische Effekte auf die TH1/TH2-Verhältnisse der Pferde am deutlichsten in Erscheinung traten. Dies war für Gliotoxin ein Bereich von 11,1 bis 25 ng/ml, für Patulin ein Bereich von 62,5 bis 250 ng/ml, für LPS ein Bereich von 10 bis 250 ng/ml und für Dexamethason ein Bereich von 0,04 bis 4 ng/ml. In den Hauptversuchen wurde dieses Testsystem angewandt, um potentielle Einflüsse eines exemplarisch gewählten, externen Umweltfaktors (unterschiedliche Einstreumaterialien) auf das TH1/TH2-Verhältnis im equinen Immunsystem nachzuweisen. Hierfür wurde eine Gruppe von sechs gesunden Warmblutstuten in einem Alter von zwei Jahren beprobt, welche in einer Mehrraum-Auslaufhaltung gehalten wurden. Die Einstreu des Ruhebereiches wurde in einem Abstand von sieben Wochen von Weizenstroh zu Holzspänen und anschließend zu Strohpellets gewechselt. Jeweils wenige Tage vor Ende einer jeden Periode erfolgte die Blutentnahme.Jede der verwendeten Noxen besaß in vitro immunmodulatorische Fähigkeiten. Die In vitro-Provokation mit Gliotoxin rief eine auf Suppression der TH1-Zellen basierende Polarisierung equiner PBMC in Richtung eines TH2-Zytokinprofils hervor, während die In vitro-Provokation mit Patulin lediglich in den Vorversuchen eine Tendenz in diese Richtung zeigte. Die Inhibition der equinen TH1-Zellen erfolgte durch beide getesteten Toxine in bereits zytotoxisch wirkenden Konzentrationsbereichen. Die Empfänglichkeit equiner PBMC für immunmodulatorische Effekte von LPS in vitro schien unterschiedlich stark ausgeprägt zu sein. Lediglich in Einzelfällen konnte ein auf einer Reduktion der TH1-Zellen beruhender Abfall des TH1/TH2-Verhältnisses beobachtet werden, während TH2-Zellen in der Regel durch LPS unbeeinflusst blieben. In vitro-Provokation mit Dexamethason führte zu einer gleichmäßigen Abnahme sowohl von Anteilen der TH1- als auch der TH2-Zellen, ohne Auswirkungen auf das TH1/TH2-Verhältnis zu besitzen.Mit Hilfe der In vitro-Provokation konnte während der Hauptversuche gezeigt werden, dass die Art des verwendeten Einstreumaterials generell das TH1/TH2-Verhältnis von Pferden beeinflussen kann. Für den Nachweis eignet sich insbesondere die In vitro-Konfrontation mit Dexamethason, gefolgt von LPS. Nach Verwendung von Spänen konnten signifikante Anstiege der TH1/TH2-Verhältnisse festgestellt werden, die auf einer Abnahme der TH2-Zellen beruhten. Gliotoxin und Patulin besaßen hingegen in den getesteten Konzentrationen eine zu hohe Zytotoxizität für die equinen PBMC der 2-jährigen Stuten.Bestimmungen equiner TH1/TH2-Verhältnisse sind anhand einer Blutprobe mit Hilfe des angewandten Testsystems möglich. Engmaschige, kinetische Untersuchungen zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit individueller TH1/TH2-Verhältnisse sind jedoch zwingend erforderlich, um die Eignung der Methode als praktikables Diagnostikum zu sichern. Durch Analyse von Gruppendynamiken konnte in dieser Arbeit ein positiver Einfluss der Einstreu Späne zugunsten eines TH1-geprägten Zytokinprofils bei Pferden gezeigt werden. Die Wahl der Einstreu dient demnach nicht nur der Vermeidung lungengängiger Staubpartikel, sondern fördert darüber hinaus TH1-Zytokinprofile, die mit der Heilung chronischer Atemwegserkrankungen in Verbindung gebracht werden A balanced activity of TH1 and TH2 committed lymphocytes is essential for the development of adequate immune responses. In turn, a TH1/TH2 dysbalance forms the centre of the pathogenesis of several equine diseases, as the symptomatic stage of the insect bite hypersensitivity (sweet itch) which is accompanied by an excessive TH2 reponse. The presumption of an increased production of TH2 cytokines during the course of recurrent airway obstruction (RAO) of the horse is discussed controversially. Standardised systems for determination of equine TH1/TH2 ratios are currently lacking, a major obstacle for unveiling the pathologic processes of this common equine disease.This doctoral thesis challenged the hypothesis, that provocation in vitro of equine peripheral blood lymphocytes with different substances allows evaluating the individual TH1/TH2 balance and thus gives insights into the immune status of a single horse.Two mycotoxins, Gliotoxin and Patulin, as well as LPS and Dexamethasone were used. Each substance represents environmental or iatrogenic factors that horses are exposed to and that are potentially capable of modulating the equine immune response. Density gradient centrifugation was used to obtain peripheral mononuclear blood cells (PBMC). Cells were incubated with each of the four substances for 20 hours, followed by another four hours of incubation with Phorbol-12-myristate-acetate (PMA), Ionomycin and Brefeldin A. Flow cytometric analysis was performed to analyse CD4+/IFN-γ+ (TH1) and IL-4+ (TH2) populations. This single cell analysis formed the basis for the calculation of TH1/TH2 ratios. In the first part of the investigation, blood samples of three clinically healthy horses were used to determine substance-specific concentration ranges for the modulation of the TH1/TH2 balance. Ranges established were 11.1-25 ng/ml for Gliotoxin, 62.5-250 ng/ml for Patulin, 10-250 ng/ml for LPS, and 0.04-4 ng/ml for Dexamethason. In a second series of experiments this testing system was applied to unveil potential influences on the equine TH1/TH2 balance of different bedding materials, an environmental variable of known impact on the clinical condition of RAO horses. For this experiment a group of six healthy, two year old warmblood mares was tested. Every seven weeks the bedding material was replaced (from straw to wood shavings to straw pellets). A blood sample was taken from each horse a few days before the end of these periods. Each substance used in the experiments had an immune modulatory activity in vitro. Incubation with Gliotoxin induced a polarisation of equine PBMC towards a TH2 cytokine profile based on a suppression of TH1 cells. In vitro-provocation with Patulin showed a similar tendency in the first part of the investigation only. Inhibition of TH1 cells by both mycotoxins was accompanied by cytotoxic effects. The susceptibility of equine PBMC to LPS varied individually. A reduction of the TH1/TH2 ratio based on a decline of TH1 cells was observed in some cases. TH2 cells remained unaffected by LPS. In vitro-provocation with Dexamethasone suppressed TH1 and TH2 cells equally leaving the TH1/TH2 ratio unaffected.The second series of experiments clearly showed that the in vitro-provocation of equine PBMC is suitable to prove an influence of bedding material on the TH1/TH2 balance in horses. This notion particularly holds after use of Dexamethasone and, to a lesser degree, after use of LPS. Using wood shavings for bedding caused a decrease of TH2 cells resulting in a significant increase of the TH1/TH2 ratio. Gliotoxin and Patulin exerted a pronounced cytotoxic effect in the tested concentrations and rendered these substances less suitable for this kind of studies. Though individual differences were observed, equine TH1/TH2 ratios can be detected by taking blood samples and applying the test system developed in this study. Kinetic investigations are mandatory for checking the reproducibility of single TH1/TH2 ratios when the method is applied as a diagnostic tool. However, the system of in vitro-provocation and subsequent flow cytometry analysis will be of great use for experimental purposes. This thesis demonstrates that, when analysing dynamics within an animal population, an impact of wood shavings as a bedding material on the equine TH1/TH2 balance becomes apparent. An appropriate choice of bedding material not only leads to a reduction of respirable dust particles but also seems to boost TH1 cytokine profiles which relate to the improvement of chronic respiratory diseases.