Vergleich des retinalen Ganglienzelltods im experimentellen autoimmunen Glaukom Tiermodell nach systemischer Immunisierung mit aufgereinigten retinalen Proteinen

Abstract

Das Glaukom stellt weltweit die zweithäufigste Ursache für eine Erblindung dar. Es handelt sich dabei um eine Vielzahl ätiologisch unterschiedlicher Krankheitsbilder, von denen meist noch sehr wenig zur Pathogenese bekannt ist. In den letzten Jahren wurde häufig über die Beteiligung einer autoimmunen Komponente am Glaukom diskutiert, da es bei vielen Patienten in der Humanmedizin ohne erhöhten intraokularen Druck (IOP) zu Ganglienzellverlusten und Gesichtsfeldausfällen kam. Auch beim Glaukom des Hundes wird vermutet, dass IOP unabhängige Faktoren eine wichtige Rolle spielen, da es trotz Absenkung des IOP bei einer Glaukomerkrankung weiterhin zur Degeneration des Sehnervenkopfes kam.Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Auswirkungen verschiedener Antigene und deren Kombination auf den Untergang retinaler Ganglienzellen zu untersuchen. Hierzu wurde das experimentelle autoimmune Glaukom Tiermodell durchgeführt, welches auf der Immunisierung von Lewis Ratten mit potentiellen Antigenen in Kombination mit Pertussis Toxin und inkompletten Freunds Adjuvant basiert. Als Antigene dienten beta-Aktin (n=4), saures Gliafaserprotein (GFAP) (n=4), Tubulin (n=4), Gliazell-abgeleiteter neutropher Faktor (GDNF) (n=8), das calciumbindende Protein S100 (n=8) sowie die Kombination von Hitzeschockprotein 27 mit GDNF bzw. S100 (jeweils n=6). Die Kontrollgruppe (n=7) erhielt anstelle des Antigens physiologische Kochsalzlösung. Die IOP Messungen und Funduskopien fanden eine Woche vor der Immunisierung, sowie zwei und vier Wochen danach statt. Am Ende der Studie erfolgte die Flatmountpräparation der Retinae. Diese wurden mit Kresylviolett angefärbt, sowie vor und nach der Färbung zur Ermittlung der trocknungsbedingten Flächenschrumpfung vermessen. Im Anschluss daran wurden unter einem Mikroskop vier zentrale und vier periphere Areale der Flatmounts fotografiert. Die Zellen dieser Areale wurden in der Image J Software manuell ausgezählt, wobei in parvo- und magnozelluläre Neurone, Gliazellen und Endothelzellen differenziert wurde.Die Messungen des Augeninnendruckes ergaben, verglichen mit der Kontrollgruppe, abhängig vom Messzeitpunkt bei der GFAP- (p=0,04) und der Tubulin-Gruppe (p=0,003) eine signifikante IOP Erhöhung, während bei der S100- (p=0,02) und der GDNF+HSP27-Gruppe (0,005) ein signifikant niedrigerer IOP gemessen wurde. Alle IOP Werte lagen trotz signifikanter Unterschiede im physiologischen Bereich. Aufgrund der geringen Anzahl von Tieren pro Immunisierungsgruppe lassen sich aus den signifikant abweichenden IOP Messwerten nur Tendenzen ableiten, die durch weitere Studien abgesichert werden müssen. Die Untersuchung der Fundi ergab bei keinem Tier einen Hinweis auf pathologische Veränderungen. Die mittlere Schrumpfung der Faltmounts betrug 12,21%, wobei nur bei der GDNF-Gruppe (p=0,04) ein signifikanter Unterschied zur Kontrolle festgestellt werden konnte. Bei der Auswertung der Neurone wiesen bis auf die beta-Aktin-Gruppe (p= 0,08), alle Gruppen gegenüber der Kontrollgruppe einen signifikanten Untergang neuronaler Zellen in der Retina auf. Hinsichtlich der parvozellulären Neurone zeigte sich bei allen Gruppen, angefangen bei beta-Aktin (p=0,04) bis hin zu S100+HSP 27 (p= 0,000001), ein signifikanter Verlust von Zellen verglichen mit der Kontrolle. Bei den magnozellulären Neuronen konnte zwar bei allen Gruppen eine Erhöhung der Zellzahl gegenüber der Kontrollgruppe ermittelt werden, jedoch war diese nur bei den Gruppen GDNF (p=0,01), S100 (p=0,0001), GDNF+HSP 27 (p=0,01) und S100+HSP27 (p=0,00002) signifikant. In der Kategorie der Gliazellen wiesen die Gruppen beta-Aktin (p=0,000007), GFAP (p=0,005) und S100 (p=0,03) eine signifikante Erhöhung im Vergleich mit der Kontrolle auf. Hinsichtlich der Endothelzellen zeigten sich keine signifikanten Auffälligkeiten.Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, dass der Untergang retinaler Ganglienzellen im experimentellen autoimmunen Glaukom Modell nicht im Zusammenhang mit der Höhe des IOP steht. Die Funduskopie scheint nicht sensibel genug zu sein, um derartige Schäden erkennen zu können.Die vermuteten Mechanismen, über die die Antigene einen Zelluntergang bewirken, sind vielfältig. Bei GFAP könnte eine vermehrte Produktion von Stickoxid oder eine Schädigung der Bluthirnschranke und der Zellmembran für den Zellverlust verantwortlich sein, während sich bei Tubulin vermutlich ein veränderter Signal- bzw. Vesikeltransport negativ auswirken könnte. Auch bei beta-Aktin könnten fehlgeleitete Signale und Neurotransmitter oder eine geschädigte Plasmamembran den Zelltod auslösen. Bei GDNF und S100 spielt die Höhe der verabreichten Dosis wahrscheinlich eine entscheidende Rolle beim Untergang der Neurone. Jedoch wird auch das Einwirken bestimmter Rezeptoren, wie dem RAGE-Rezeptor bei S100 und zweier Glutamatrezeptoren bei GDNF, in Betracht gezogen. S100 könnte ebenso über eine Erhöhung der Produktion von Stickoxid oder Beeinträchtigung des Zytoskeletts negative Auswirkungen auf Neurone haben. HSP 27 nimmt, wie bei GFAP und S100 auch vermutet, Einfluss auf Bestandteile des Zytoskeletts und kann so die Apoptose auslösen. Daneben könnte HSP 27 auch eine überschießende Immunantwort auslösen, bei der eine T-Zell mediierte Toxizität zum Tod der Zellen führt.In folgenden Arbeiten sollte der Mechanismus, der bei der Immunisierung mit den verwendeten Antigenen zum Ganglienzellverlust geführt hat, intensiver untersucht werden. Des Weiteren wäre von Interesse, ab welchen Konzentrationen und Studienlaufzeiten sich manche Antigene positiv oder negativ auf das Überleben der Zellen auswirken und wie dies durch Mehrfach-Kombinationen der Antigene beeinflusst wird. Glaucoma is the second leading cause of blindness worldwide. There is a variety of aetiological different disease patterns, of which very little is known about the pathogenesis. In recent years, the participation of an autoimmune component in glaucoma has been discussed frequently, since many patients in human medicine without increased intraocular pressure (IOP) experience ganglion cell loss and visual field defects. Even in glaucoma of dogs it is suspected that IOP-independent factors play an important role, because despite lowering of IOP in these glaucomatous dogs degeneration of the optic nerve head continues.The aim of this study was to investigate the effects of different antigens and their combination on the loss of retinal ganglion cells. For this, the experimental autoimmune glaucoma animal model based on the immunization of Lewis rats with potential antigens in combination with pertussis toxin and incomplete Freund´s adjuvant was conducted. Beta-Actin (n=4), glial fibrillary acidic protein (GFAP) (n=4), tubulin (n=4), glial-derived neutrophiles factor (GDNF) (n=8), the calcium-binding protein S100 (n=8) and the combination of heat shock protein 27 (HSP 27) with GDNF or S100 (n=6) were used as antigens. The control-group (n=7) received physiological saline instead of an antigen. One week before the immunization took place and two and four weeks after this the IOP measurements and fundus-examinations were performed. At the end of the study flatmounts of all retinae were prepared. These were stained with cresyl violet and measured before and after staining to determine the surface shrinkage due to the drying procedure. Subsequently four central and four peripheral areas of the flatmounts were photographed under a microscope. The cells of these areas were counted manually by using Image J software. The following cell types were differentiated: parvo- and magnocellular neurons, glial cells and endothelial cells.The IOP measurements were compared with the control group and depending on the point in time at which IOP was measured the GFAP- (p=0.04) and the tubulin-group (p=0.003) showed a significant IOP increase, while the S100- (p=0.02) and the GDNF+HSP 27-group (p=0.005) showed a significantly lower IOP. In spite of significant differences, all IOP values were in the physiological range. Due to the small number of animals per immunization group, only tendencies of the significant different IOP measurements can be derived and have to be verified by other studies. The examination of the fundi revealed no evidence of pathological changes in any animal. The average shrinking of flatmounts was 12.21%, only in the GDNF-group (p=0.04) a significant difference from control could be found. In the evaluation of the neurons all groups, respectively beta-actin (p=0.08), showed a significant decline of neuronal cells in the retina compared with the control-group. A significant loss of parvocellular neurons in all groups compared to the control-group, starting with beta-actin (p=0.04) to S100+HSP 27 (p=0.000001) was observed. Regarding the number of magnocellular neurons in all groups an increase in the number of cells was determined with respect to the control group, but only in the GDNF- (p=0.01), S100- (p=0.0001), GDNF+HSP 27- (p=0.01) and S100+HSP 27-group (p=0.00002) this increase was significant. In the category of glial cells, the groups beta-actin (p=0.000007), GFAP (p=0.005) and S100 (p=0.03) showed a significant increase compared with the control. Regarding the endothelial cells no significant differences were determined.The results of this study suggest that the decline of retinal ganglion cells in experimental autoimmune glaucoma model is not related to the height of the IOP. The funduscopy seems to be not sensitive enough to detect such damage.The potential mechanisms by which antigens cause cell death are manifold. In GFAP-group increased production of nitric oxide or damage to the blood brain barrier and the cell membrane could be responsible for cell loss, while in tubulin-group presumably an altered signaling and vesicle trafficking could have negative effects. Also in the beta-actin-group misrouted signals and neurotransmitter or a damaged plasma membran could trigger cell death. In GDNF- and S100-group the amount of the administered dose could probably play a critical role in the demise of neurons. However, even the effect of certain receptors, such as the RAGE receptor in S100- and two glutamate receptors in GDNF-group will be considered. S100 could also have a negative impact on neurons by increase of nitric oxide production or the impairment of the cytoskeleton. HSP 27 takes effect on components of the cytoskeleton, suspected as well as for GFAP and S100, which can trigger apoptosis. HSP 27 could also trigger an excessive immune response in which a T cell-mediated toxicity leads to cell death.In following studies, the details of the mechanism that has resulted in ganglion cell loss after the immunization with the used antigens should be further investigated. In addition, it would be of interest, from which concentration and study periods, some antigens have a positive or negative effect on the survival of cells and how it is influenced by multiple combinations of antigens.