Untersuchungen zur immunhistologischen Darstellung von CD8+ T-Lymphozyten in paraffineingebettetem, lymphatischem Gewebe der Katze

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, unter Verwendung der ZSF-Fixierung nach Beckstead (1994) und der kommerziellen HOPE® Fixierung die Eignung dieser beiden alternati-ven aldehydfreien Fixierungsverfahren für die immunhistologische Darstellung von CD8+ T Lymphozyten in paraffineingebettetem, lymphatischem Gewebe der Katze zu untersuchen.2. In der Literaturübersicht wird zunächst die Problematik der immunhistologischen Dar-stellung von fixierungs- und prozessierungssensitiven Antigenen am Beispiel des T Lymphozytendifferenzierungsantigens CD8 erläutert. Im Anschluss werden die bei-den alternativen Fixierungsverfahren vorgestellt und ein kurzer Überblick über ihren bisherigen Einsatz in der Forschung unter besonderer Berücksichtigung des immunhis-tologischen Nachweises von CD8+ T Lymphozyten in diversen Geweben verschiede-ner Spezies gegeben.3. Milz und Mesenterialllymphknoten von zwölf Katzen wurden jeweils parallel der Formalin-, HOPE®- und ZSF-Fixierung unterzogen, prozessiert und in Paraffin einge-bettet. Zusätzlich wurden jeweils Gefrierblöcke angefertigt, die als Positivkontrollen und als Standard für die Beurteilung der Färbeintensität dienten. Bei der ZSF-Fixierung erfolgte die Prozessierung nach einem institutsinternen modifizierten Proto-koll, nachdem in Vorversuchen in dem auf diese Weise prozessierten Gewebe ein po-sitiver Nachweis des T-Zelldifferenzierungsantigens CD8 hatte erzielt werden können. Die unterschiedlich fixierten Proben eines Tieres wurden jeweils parallel in einem In-kubationsansatz gefärbt und die Formalin-, HOPE®- und ZSF-fixierten Proben hin-sichtlich ihrer Färbeintensität (Intensität des Signals und Anzahl der eindeutig positi-ven Zellen) mit der jeweiligen Gefrierschnittkontrolle verglichen.4. Eine immunhistologische Darstellung von CD8+ T-Lymphozyten in formalinfixiertem Material war bei keiner Probe möglich.5. Unter Verwendung der HOPE®-Fixierung gelang bei allen Proben der Nachweis von CD8+ T-Lymphozyten, sofern im Hinblick auf postmortale Veränderungen ein mor-phologischer Strukturerhalt des Ausgangsmaterials gegeben war. Die Gefrierschnitt-kontrollen wiesen jedoch gegenüber den HOPE®-fixierten Proben in allen Fällen einen überlegenen Antigenerhalt auf; hingegen zeigten sie einen deutlich schlechteren Mor-phologieerhalt als diese. Im Vergleich zu formalinfixiertem Material war der Morpho-logieerhalt von HOPE®-fixiertem Gewebe geringfügig herabgesetzt.6. In ZSF-fixiertem Material gelang lediglich bei drei von zwölf Tieren ein Nachweis von CD8+ T Lymphozyten. Der Morphologieerhalt in ZSF-fixiertem Material wurde als vergleichbar mit formalinfixiertem Material beurteilt und war dem von Gefrier-schnitten deutlich überlegen.

The aim of the study was the immunohistological demonstration of CD8+ T cells in paraffin-embedded feline lymphoid tissues by using two alternative aldehyde-free fixation methods: the ZSF-fixation published by Beckstead (1994) and the commercial HOPE®-fixation.2. Using the example of the CD8-antigen of T-cells, the problem of the immunohis-tological detection of fixation- and processing-sensitive antigens is briefly outlined. The two alternative fixation methods are introduced and a short review on their previ-ous fields of application is given with particular regard to the immunohistological demonstration of CD8+ T-cells in tissues of various species.3. Specimens of spleen and mesenterial lymph nodes of twelve cats were fixed with for-malin, HOPE® and ZSF, processed and subsequently embedded in paraffin respec-tively. A portion of each tissue was snap-frozen for comparison. Regarding ZSF-fixation, a modified in-house protocol was used after preceeding experiments had shown that the T cell marker CD8 could be detected in specimens processed according to this modified protocol. The paraffin-embedded as well as the frozen sections were stained immunohistologically in parallel. Finally, the formalin-, HOPE®- and ZSF-fixed sections were compared to the frozen section control with regard to number of cells staining and intensity of staining.4. CD8+ T cells could not be demonstrated in any of the formalin-fixed specimens.5. CD8+ T cells could be detected in all HOPE®-fixed specimens provided that structural preservation of tissue was given with regard to postmortal changes. Frozen sections showed superior antigen preservation but reduced morphological preservation com-pared to HOPE®-fixed sections. Compared to formalin-fixed material morphological preservation of HOPE®-fixed tissue was slightly inferior.6. Positive labelling of CD8+ T cells could be found in ZSF-fixed tissues of only three of twelve cats. Morphological preservation of ZSF-fixed specimens was comparable to formalin-fixed material and considerably superior to frozen sections.