Charakterisierung der Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-IL6 an der Induktion zentralnervös kontrollierter Krankheitssymptome in der Ratte

Abstract

Systemische Entzündungsreaktionen gehen mit charakteristischen Symptomen wie Fieber, Anorexie, Adipsie, Lethargie und Verminderung der Körpermasse einher. Diese unterliegen der zentralnervösen Kontrolle und werden zusammengefasst auch als sickness-behavior bezeichnet. Lipopolysaccharid (LPS), ein Zellwandbestandteil gram-negativer Bakterien, gehört zu einer Gruppe von hoch konservierten, pathogentypischen Molekülstrukturen, den sog. pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). LPS löst nach experimenteller, systemischer Applikation in Ratten zuverlässig und reproduzierbar den Symptomkomplex sickness-behavior aus. Für die Übermittlung inflammatorischer Stimuli aus der Peripherie an übergeordnete, regulatorische Zentren des ZNS hat unter anderem der sogenannte humorale Signalweg eine zentrale Bedeutung. Er beschreibt das Einwirken zirkulierender Mediatoren auf bestimmte, exponierte Gehirnareale und die nachfolgende Weiterleitung der entsprechenden Signale zu spezifischen Gehirnstrukturen. Dabei kommt den sogenannten circumventrikulären Organen (CVO) eine zentrale Rolle zu, da ihre im Allgemeinen als undicht bezeichnete Blut-Hirn-Schranke den direkten Kontakt von Signalmolekülen mit Hirnzellen ermöglicht. Des Weiteren sind vor allem Endothelzellen des Gehirns und perivaskuläre Makrophagen an der Signalübermittlung beteiligt. Die am Ende verschiedener Kommunikationswege zwischen Peripherie und ZNS stehende, genomische Aktivierung von Zellen innerhalb der entsprechenden regulatorischen Zentren im Hypothalamus wird über spezifische Transkriptionsfaktoren vermittelt, die damit gleichzeitig als Aktivierungsmarker im Gehirn angesehen und zur Darstellung entsprechender Aktivierungsvorgänge verwendet werden können. Neuroanatomisch charakteristische Ex¬pres¬sions¬muster nach systemischer Inflammation wurden in der Vergangenheit im Gehirn z.B. für die Transkriptionsfaktoren NF kappaB und STAT3 aufgezeigt, die vorrangig mit der Induktion aber auch der Aufrechterhaltung zentralnervös kontrollierter Krankheitssymptome in Verbindung gebracht werden. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die neuroanatomische Charakterisierung des Transkrip¬tions¬faktors NF IL6 (Nuclear Factor IL-6), einem Mitglied der sog. Transkriptionsfaktor-Superfamilie bZIP . Im Speziellen wurde seine spezifische Rolle im Gehirn für die Induktion, Ausprägung und Aufrechterhaltung von Krankheitssymptomen, sowie sein Zusammenspiel mit STAT3 und NF kappaB im Verlauf systemischer Inflammations¬reak¬tio¬nen näher untersucht.In drei einzelnen Teilstudien stellte sich NF IL6 nach intraperitonealer Injektion von 100 µg bzw. 1 mg/kg KM LPS gegenüber PBS-behandelten Kontrollen als ein weiterer Aktivierungsmarker im Gehirn dar. Erstmalig konnte ein deutliches, zeitabhängiges Muster der LPS-induzierten NF IL6-Immunreaktivität (I.R.) gezeigt werden. Dabei trat die maximale Signaldichte und -intensität im Gehirn im Zeitraum zwischen 6 und 8 Stunden nach einem LPS-Stimulus auf und konzentrierte sich auf Hirnstrukturen und Zellen, die an der Übermittlung und Weiterleitung peripherer inflammatorischer Signale an das ZNS und der Induktion und Aufrechterhaltung zentralnervös kontrollierter Krankheitssymptome beteiligt sind. Dazu gehörten z.B. die sensorischen CVO (Organum vasculosum laminae terminalis, OVLT; Organum subfornicale, SFO; Area postrema, AP) und Zellen der Blut-Hirn-Schranke. Eindeutig konnte erstmals neben Astrozyten, Mikrogliazellen und Neuronen außerdem die Bedeutung von NF IL6 in Endothelzellen und perivaskulären Makrophagen im Gehirn demonstriert werden. Entsprechend dieser Ergebnisse scheint NF IL6 ein neuer später Zellaktivierungsmarker zu sein, der möglicherweise anders als bisher bekannte Marker, zellübergreifend und auch im Verlauf längerfristiger und / oder chronischer Entzündungsreaktionen im Gehirn, für Untersuchungen sowohl direkter nervaler als auch humoraler Kommunikationswege zwischen Gehirn und Peripherie geeignet ist. Als Hauptregulationsmechanismus der NF IL6-Aktivität im Rahmen LPS-bedingter Inflammationsreaktionen trat die de novo Synthese von NF IL6 in den Vordergrund. Die aktivierende Isoform des Proteins (LAP) wurde nach Stimulation mit 100 µg/kg KM LPS im Western Blot und immunhistochemisch im Vergleich zu Kontrolltieren vermehrt im Gehirn nachgewiesen.Funktionell ist eine Rolle von NF IL6 anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sowohl für die Aufrechterhaltung von zentralnervös kontrollierten Krankheitssymptomen, als auch für deren Abklingen denkbar; der Transkriptionsfaktor scheint sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften aufzuweisen. So korrelierte die maximale LPS-bedingte NF IL6 I.R. nach Verabreichung von 100 µg bzw. 1 mg/kg LPS mit der Plateauphase bzw. einer jeweils stabilen Phase des resultierenden Fiebers, sowie einer verlängerten Expression des wichtigen Mediators IL 6 im Blutkreislauf. Parallel wurden potentielle pro-inflammatorische (COX2, mPGES, IL 1& #946;), sowie anti-inflammatorische (IL 10) NF IL6-Zielgene im Hypothalamus induziert. Außerdem verursachte die gezielte Blockade einer JAK2-vermittelten NF IL6-Aktivierung im Gehirn, verbunden mit der gleichzeitigen Inhibition der STAT3-Aktivierung, durch den spezifischen Inhibitor AG490 (3 µg, intracerebroventrikulär; i.c.v.) dissoziierende Veränderungen von LPS-induzierten Krankheitssymptomen im Vergleich zu Kontrolltieren, die nur mit dem entsprechenden Lösungsmittel behandelt worden waren. Die Ausprägung dieser Symptome wurde durch die JAK2-Inhibition sowohl teilweise verstärkt (Fieber) als auch vermindert (Lethargie, Adipsie). Hier zeigte sich vor allem ein bedeutender Zusammenhang von STAT3- und NF IL6-bedingten Signalwegen für die IL 10-Expression im Hypothalamus, da die mRNA-Expression dieses Gens durch die Behandlung mit AG490 signifikant beeinflusst wurde. Außerdem wurde für COX2, mPGES und TNF& #945; die Bedeutung der Kombination von STAT3 und NF IL6 für die hypothalamische Expression in vivo herausgearbeitet. Als mögliches Stoppsignal der NF IL6-Aktivierung im Gehirn konnte in dieser Arbeit erstmalig Trib1 charakterisiert werden.Anhand der vorliegenden Ergebnisse sind für die Induktion, Aufrechterhaltung und Beendigung zentralnervös kontrollierter Krankheitssymptome sowohl synergistische, als auch zeitlich aufeinander aufbauende Funktionen der Transkriptionsfaktoren NF kappaB, STAT3 und nachfolgend NF IL6 anzunehmen. Durch die angewendete Methodik der i.c.v. Verabreichung von AG490 oder anti-NF IL6-siRNA wurden über die zentrale Fragestellung hinaus zusätzliche, interessante Erkenntnisse gewonnen. So untermauerten die entsprechenden Teilstudien die zentrale Rolle von NF IL6 für die Aktivierung von Mikrogliazellen durch pro-inflammatorische Mediatoren oder mechanische bzw. traumatische Einflüsse sowohl in vitro als auch in vivo. Auf methodologischer Ebene zeigt die vorliegende Arbeit zusätzlich Grenzen der Anwendung der RNAi in vivo, vor allem in Bezug auf die Untersuchung inflammatorischer Prozesse im Gehirn auf. Für zukünftige, weiterführende Studien stellt vor allem die Rolle von NF IL6 auf verschiedenen Ebenen der HPA-Stressachse, die in der vorliegenden Arbeit insbesondere anhand langfristiger, anti-inflammatorischer Effekte deutlich wurde, eine vielversprechende Fragestellung dar. Neben einem besseren Verständnis bzw. neuen Erklärungsansätzen der komplizierten Mechanismen, die das Zusammenspiel inflammatorischer Mediatoren und Transkriptionsfaktoren untereinander regeln und letztendlich die zentralnervöse Kontrolle peripher ausgelöster Krankheitssymptome ermöglichen, bieten die vorliegenden Ergebnisse zur möglichen Bedeutung von NF IL6 auch neue Anhaltspunkte für die Entwicklung therapeutischer Ansätze. Außer dem inflammatorischen Stoppsignal Trib1 ist insbesondere die beobachtete Dissoziation von Fieber und anderen Krankheitssymptomen nach zentraler Anwendung des JAK2-Inhibitors AG490 von Bedeutung und könnte die gezielte Bekämpfung unerwünschter Krankheitssymptome bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung der im Zuge der In¬fek¬tions¬ab¬wehr bedeutsamen Fieberreaktion erlauben. Nicht zuletzt bietet das in der vorliegenden Arbeit zeitlich charakterisierte LPS-induzierte Aktivierungsmuster von NF IL6 im Gehirn von Ratten eine wichtige Grundlage für die Verwendung von NF IL6 als neuer später Aktivierungsmarker zur zukünftigen Klärung weiterer Fragestellungen aus dem Bereich der neuroimmunologischen Grundlagenforschung. Systemic inflammation is associated with characteristic brain-controlled symptoms, such as fever, anorexia, adipsia, lethargy and weight loss, which are frequently referred to as sickness-behavior . Lipopolysaccharide (LPS), a component of Gram-negative bacterial cell walls, belongs to a group of highly conserved molecular structures which are expressed by several pathogens and commonly known as pathogen-associated molecular pattern (PAMPs). Experimental systemic application of LPS consistently evokes sickness-behavior in a reproducible manner. The so-called humoral pathway, amongst other pathways, plays a significant role in the transmission of inflammatory stimuli from the periphery to the regulatory areas of the CNS. It describes the action of circulating mediators on special, exposed regions within the brain that finally leads to a transmission of these signals to specific brain structures. In this scenario circumventricular organs (CVOs) are important structures because of their leaky blood-brain barrier that allows circulating mediators to gain direct access to brain cells. In addition, brain endothelial cells and perivascular macrophages participate in this signal transmission. The consequence of different communication pathways between the periphery and the brain is the genomic activation of cells within regulatory hypothalamic centers, which is mediated by the activation of specific transcription factors. Therefore these transcription factors can be considered as brain activation markers and used to visualize the respective activation processes within different brain structures. In the past, neuroanatomically characteristic expression patterns in the brain have been described for the transcription factors NF kappaB and STAT3, which are primarily linked to the induction, but also the maintenance of brain-controlled sickness symptoms. The present study is focused on the neuroanatomical characterization of the transcription factor NF IL6 (Nuclear Factor IL 6), a member of the so-called bZIP family of transcription factors. The major areas investigated were the specific role of NF IL6 in the brain during the induction, development and maintenance of sickness symptoms, as well as its interaction with STAT3 and NF kappaB during systemic inflammation.The three parts of the study revealed NF IL6 as another activation marker in the brain following administration of moderate (100 µg) or high (1 mg/kg) doses of LPS, in comparison to PBS-treated controls. For the first time a clear time-dependent pattern of LPS-induced NF IL6-immunoreactivity (I.R.) could be demonstrated. The density and intensity of the signals peaked at 6 to 8 hours after the LPS-stimulus and accumulated primarily in brain structures and -cells that are involved in the transmission and forwarding of peripheral inflammatory signals to the CNS, and the induction and maintenance of brain-controlled sickness symptoms. These are for instance the sensory CVOs (Vascular organ of the lamina terminalis, OVLT; Subfornical organ, SFO; Area postrema, AP) and cells belonging to the blood-brain barrier. Besides astrocytes, microglial cells and neurons, the significance of NF IL6 was unequivocally shown in brain endothelial cells and perivascular macrophages for the first time. Based on these results, NF IL6 seems to be a novel, delayed early activation marker, which possibly, unlike other markers, can also be used to analyze the different cell types involved in humoral, as well as direct neuronal pathways during long-term an / or chronic inflammatory processes in the brain. The main regulatory mechanism of NF IL6 activity in this study turned out to be de novo synthesis of the transcription factor itself. Following stimulation with LPS (100 µg/kg) immunohistochemical, as well as Western Blot analyses revealed increased concentrations of the activating isoform of the protein (LAP) in the brain, compared to PBS-injected controls.According to the present study, NF IL6 could be involved in the maintenance, as well as the termination, of brain-controlled sickness symptoms on a functional level, as there seems to be both, a pro- and an anti-inflammatory potential for this transcription factor. Thus, LPS-induced NF IL6-I.R. peaked in parallel with the plateau phase of the resulting febrile response after injection of 100 µg or 1 mg/kg LPS, respectively. The peak in NF IL6-I.R. was also related to a sustained expression of the important mediator IL-6 within the circulation. Moreover, possible pro-inflammatory (COX2, mPGES, IL 1β) and anti-inflammatory (IL 10) NF IL6 target genes were induced in the hypothalamus simultaneously. The selective blockade of a JAK2-mediated NF IL6-activation in the brain, in conjunction with the inhibition of STAT3-activation, which was achieved by using the specific inhibitor AG490 (3 µg, intracerebroventricular; i.c.v.), lead to dissociating changes of LPS-induced sickness symptoms in comparison to vehicle-treated control animals. The intensity of the fever increased while lethargy and adipsia were decreased by JAK2-inhibition. These results underline the importance of signaling pathways that include a cooperative activation of STAT3 and NF IL6, particularly for the hypothalamic expression of IL 10, because mRNA-expression of this gene was significantly influenced by AG490-treatment. Furthermore, we were able to demonstrate the importance of the combined expression of STAT3 and NF IL6 for the hypothalamic expression of COX2, mPGES and TNFα in vivo. For the first time, this study illustrates the function of Trib1 as a possible stop signal of NF IL6-activation in the brain.Based on the present results, the induction, maintenance and termination of brain-controlled sickness symptoms are likely to be synergistically and successively mediated by NF kappaB, STAT3 and, at a later time point, NF IL6.Because of the i.c.v. route of administration of AG490 or anti-NF IL6-siRNA, interesting supplementary findings were obtained that exceeded the original purpose of the study: The respective experiments pointed out the important role of NF IL6 for the activation of microglial cells by pro-inflammatory mediators or mechanical / traumatic insults in vitro, as well as in vivo. Moreover, the present study demonstrates on a methodological level, existing limitations for the use of RNAi in vivo, especially when it comes to the analysis of inflammatory processes in the brain. The role of NF IL6 on different levels of HPA-axis activation, that became apparent particularly within the scope of anti-inflammatory long-term effects in the present study, might be of interest for future studies. In addition to new insights concerning the complex mechanisms that regulate the interaction of inflammatory mediators and transcription factors between the periphery and the brain that finally lead to the induction of sickness symptoms, the present study provides new indications on the possible role of NF IL6 in the development of therapeutic approaches to manage acute or chronic inflammatory processes. Besides identifying the inflammatory stop-signal Trib1, the observed dissociation of fever and other sickness symptoms following central administration of the JAK2-inhibitor AG490, is of particular interest, as this could allow targeted reduction of unwanted symptoms while maintaining the febrile response, which is of specific importance for the defense of infectious diseases.Overall, the present study provides a spatiotemporal characterization of NF IL6-acti¬va¬tion in the rat brain, an important basis for the utilization of this transcription factor as a new delayed early activation marker in future studies, aiming to solve further questions arising in the neuroimmunological area of basic research.