Rekonstruktion von kritischen Knochendefekten am Kiefer immundefizienter Ratten durch xenogene Transplantation humaner adulter fettabgeleiteter Stammzellen

Abstract

Durch die Kombination biokompatibler Tragerstoffe (Kollagen und Fibrin) mit undifferenzierten humanen fettabgeleiteten Stammzellen (adipose derived stem cells, ADSC), soll ein vitales Knochenersatzmaterial entwickelt werden, um die osteogene Potenz der ADSC in vitro zu evaluieren. Weiterhin soll eine mogliche Alternative zum limitierten autologen Knochentransplantat als Goldstandard im Knochenremodelling beim kleinen Haussaugetier bzw. bei Kindern gefunden werden. ADSC stellen eine gut zugangliche Alternative zu den bekannten und weit verbreiteten Knochenmarkstammzellen (bone marrow stem cells, BMSC) dar. ADSC zeichnen sich in vitro durch eine exzellente Proliferationsfahigkeit und eine mit BMSC vergleichbare Differenzierungsfahigkeit aus. In vivo Studien zum Einsatz dieser Zellquelle in Kombination mit Fibrinkleber oder Kollagentragermaterial in einem xenogenen Transplatatmodell im critical size Defektmodell am Unterkiefer der immuninkompetenten Ratte (Crl:NIH-Foxn1rnu) existieren bisher nicht. Durch den Nachweis einer stammzellspezifischen Oberflachenmarkerexpression der isolierten Zellen kann in dieser Studie eine erfolgreiche Isolierung humaner ADSC in vitro bewiesen werden. Am Unterkiefer der Ratte ist ein 5mm (Durchmesser) groser Defekt als Defekt kritischer Grose (critical size defect) definiert. Zur Defektfullung werden ADSC in Kombination mit Fibrinkleber oder einem scaffold (Tragermaterial) aus Kollagen verwendet und mit einer Methode des protected bone healing (pbh), autologem Knochentransplantat und den Kontrollen ohne Therapie und scaffold ohne Zellen verglichen. Zur Beurteilung des zeitlichen Ablaufs der Knochenneubildung wurde am Tag der Operation und 1,2,4 und 8 Wochen nach dem chirurgischen Eingriff radiologische Untersuchungen in vivo mit einem hochauflosenden flat-panel Volumen Computertomographen (fpvCT) durchgefuhrt und mit Hilfe von frei zuganglicher Software MicroView 2.1.2 (GE Health Care, New York, USA) und OsiriX Imaging Software 3.8.1 64 bit (Pixmeo SARL, Bernex, Schweiz) quantitativ ausgewertet. In Versuchsgruppe 1 zeigte die Methode des pbh zum Ende der Studie nach 8 Wochen Heilungsverlauf keine signifikant grosere Knochenregeneration im Defektbereich im Vergleich zu Kontrolle ohne Therapie (Knochenvolumen p= 0,389; ossifizierte Defektflache p= 0,502). Die Kombination von humanen ADSC mit Fibrinkleber und pbh zeigte in Versuchsgruppe 2 eine signifikant grosere Knochenneubildung im Vergleich zur Kontrolle mit ausschlieslich pbh (Knochenvolumen p= 0,015; ossifizierte Defektflache p= 0,019). Auch die autologe Transplantatgruppe in Versuchsgruppe 3 zeigte eine signifikant grosere Knochenregeneration im Vergleich mit der Kontrolle ohne Therapie (Knochenvolumen p= 0,0003; ossifizierte Defektflache p= 0,0001). In der Versuchsgruppe 4 mit Kollagenscaffold und ADSC zeigt sich keine signifikant grosere Knochenvolumenzunahme (p= 0,133) jedoch eine signifikant grosere ossifizierte Defektflache (p= 0,006) im Vergleich zur Therapieseite mit ausschlieslich Kollagenscaffold. In der Versuchsgruppe 5 mit ADSC in Kombination mit Fibrinkleber und pbh zeigte sich keine signifikant grosere Knochenregeneration im Vergleich zur Therapieseite mit ADSC in Kombination mit Kollagenscaffold und pbh (Knochenvolumen p= 0,724; ossifizierte Defektflache p= 0,419). Nach 8-wochiger Standzeit wurden die Tiere euthanasiert, der Unterkieferknochen explantiert und histologisch analysiert. Die Beurteilung der mit Hamatoxylin-Eosin, nach Goldner und Masson-Trichrom gefarbten Schnitte erfolgte qualitativ. Auf der Kontrollseite ohne Therapie ist das umliegende Muskelgewebe in den Defekt vorgefallen und hat somit eine Knochenheilung in diesem Bereich erschwert. Auf der Therapieseite mit pbh sind diese vor dem umgebenden Weichteilgewebe geschutzt. Es war in keinem der histologischen Schnitte eine komplette knocherne Durchbauung des critical size defect zu erkennen. Die Therapieseiten mit ADSC in Kombination mit Fibrinkleber und pbh zeigten eine qualitativ gute Knochenregeneration im gesamten Defektbereich. In Versuchsgruppe 3 fullen die autologen Knochentransplantate den Defektbereich aus. Es handelt sich um vitale reife Knochenfragmente. In Versuchsgruppegruppe 4 mit scaffold in Kombination mit ADSC oder ohne ADSC findet keine Knochenneubildung statt. Muskelgewebe ist in den Defektbereich vorgefallen und fullt diesen aus. In Versuchsgruppe 5 zeigt die Therapieseite mit ADSC in Kombination mit Kollagenscaffold und pbh eine qualitativ gute Knochenregeneration im gesamten Defektbereich. Die vorliegende Studie zeigt, dass sich ADSC in Kombination mit Fibrinkleber und protected bone healing fur den Einsatz im bone tissue engineering eignen. Using a combination of a biocompatible scaffold (collagen and fibrin) and undifferentiated human adipose-derived stem cells (ADSC), this study attempt to develop a vital bone substitute to evaluate the osteogenic potency of ADSC in vitro. Furthermore, a possible alternative to limited autologous bone graft as the gold standard in bone remodeling in small animals and children is sought. ADSC represent an easily accessible alternative to bone marrow-derived stem cells (BMSC). ADSC are characterized by excellent proliferation with a differentiation capacity comparable to BMSC. There have been no previous in vivo studies to evaluate the use of this cell source in combination with fibrin glue or collagen scaffold in a xenogenic transplantation model in a critical-size defect of the immunoincompetent rat mandible (Crl: NIH-Foxn1rnu). Stem cell-specific surface marker expression of the isolated cell population is determined in this study. A defect 5-mm in diameter in the rat mandible is defined as a critical-size defect. To bridge the defect, ADSC are used in combination with fibrin glue or a collagen scaffold and the protected bone healing (pbh) method, and the results were compared with autologous bone graft, controls without therapy, and scaffold without cells. To document the in vivo healing process, highresolution flat-panel volume computed tomography (fpvCT) is performed on the day of surgery and 1, 2, 4, and 8 weeks thereafter; quantitative analysis is performed using the open source software programs MicroView 2.1.2 (GE Healthcare, New York, NY, USA) and OsiriX Imaging software 3.8.1 64-bit (Pixmeo SARL, Bernex, Switzerland). In treatment group 1 at the endpoint of the study (8 weeks post-surgery), there is no significant difference in bone regeneration on the pbh side compare to the control side (p = 0.389 bone volume, p = 0.502 ossified defect area). However, the combination of human ADSC with fibrin glue and pbh (treatment group 2) show significantly increase bone formation compare with pbh alone (bone volume p = 0.015; ossified defect area p =0.019). In treatment group 3, the autologous bone graft side show significantly increase bone regeneration compare to the control side (bone volume p = 0.0003; ossified defect area p = 0.0001). There is no significant difference in bone volume in treatment group 4 between the collagen scaffold sides with and without ADSC, but significantly more ossified defect area (p = 0.006). In treatment group 5, the ADSC in combination with fibrin glue and pbh side show significantly increase bone regeneration compare to the ADSC in combination with collagen scaffold and pbh side (bone volume p = 0.724, ossified defect area p = 0.419). The animals are sacrificed 8 weeks after surgery, and the specimens are explanted for histological analysis. Sections stain with hematoxylin-eosin, Goldner, and Masson s Trichrome are subjected to qualitative evaluation. In the control side of all evaluate specimens, the surrounding muscle tissue prolapse into the defect. On the treatment with pbh side, the defect is protected from the surrounding muscle tissue. Complete ossification of the defect area is not observed in any of the specimens. The treatment side with ADSC in combination with fibrin glue and pbh show complete ossification in the whole defect area. The autologous bone graft fills the defect with vital bone fragments. No bone regeneration is detected in treatment group 4 with only collagen scaffold or in combination with ADSC. Here, muscle tissue prolapse into the defect area. In treatment group 5, the specimens with ADSC in combination with collagen scaffold and pbh show complete ossification of the defect area with thick, newly formed bone. The results of this study indicate that treatment with ADSC in combination with fibrin glue and pbh is suitable for bone tissue engineering.