Durchflusszytometrischer Nachweis von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis-spezifischen Antikörpern im Blut von Rindern

Abstract

Neben dem zeit¬auf¬wendigen und kost¬spieligen direkten Nachweis von Mycobacterium avium subsp. para¬tuber¬cu¬losis (MAP) mittels Kultur oder PCR, wird zur Erkennung von MAP-infizierten Rindern gegenwärtig der ELISA eingesetzt. Die derzeit erhältlichen ELISAs zum Nachweis einer Infektion mit MAP weisen jedoch entweder eine niedrige Sensitivität oder eine niedrige Spezifität auf (Nielsen und Toft, 2008). Deshalb war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, neue, auf der Durchflusszytometrie (DFZM) basierende Verfahren zum Nachweis MAP-spezifischer Anti¬körper zu etablieren und zu evaluieren. Dazu sollten diese DFZM-Ak-Tests an experimentell mit MAP infizierten Kälbern und an natürlich MAP-infizierten Rindern im Vergleich zum Pourquier®-ELISA und zum MAP-Direktnachweis geprüft werden.Bei der Untersuchung der Serumproben von 22 MAP-negativen und 18 MAP-positiven adulten Rindern erreichte der DFZM-IgG1-Test im Vergleich zu 3 in Deutschland lizensierten ELISAs die höchste Sensitivität. Betrachtet man die Kotuntersuchung als Goldstandard, so erreichte der DFZM-IgG1-Test nach ROC-Analyse bei gerade 100 %iger Spezifität eine Sensitivität von 77,8 %. Bei Verwendung der vom Hersteller angegebenen Cut Off-Werte erreichten die ELISAs nur Sensitivitäten von 61,1 % (Pourquier®-ELISA) bzw. 27,8 % (Cattletype®-ELISA) bzw. 27,8 % (Svanovir®-ELISA) bei 100 %iger Spezifität.In einer longitudinalen Studie der experimentellen MAP-Infektion wurden 6 Kälber oral mit 1 x 109 KbE des MAP-Stammes K10 inokuliert. Weitere 6 Kälber wurden schein¬inokuliert und dienten als Kontrollgruppe. Im DFZM-IgG- bzw. DFZM-IgG1-Test wurde bei 2 von 5 Kälbern ab der 44. bzw. 46. Woche post infectionem (W.p.i.) eine Serokonversion der MAP-spezifischen Antikörper nachgewiesen. Bei keinem Kalb kam es zum Anstieg MAP-spezifischer IgG2- oder IgM-Antikörper. Im Pourquier®-ELISA reagierten 5 Kälber stets seronegativ, ein Kalb erzielte zu den letzten beiden Beprobungszeitpunkten (50. und 52. W.p.i.) ein serologisch fragliches Ergebnis.Die Dynamik von MAP-spezifischen maternalen Antikörpern wurde an je 6 Kälbern aus seropositiven und seronegativen Muttertieren untersucht. Bei allen 6 Kälbern aus seropositiven Mutter¬tieren waren nach der Kolostrumaufnahme MAP-spezifische Antikörper mit dem DFZM-IgG- bzw. DFZM-IgG1-Test nachweisbar, deren Titer in den folgenden Wochen kontinuierlich sank. Je größer der Titer bei der ersten Untersuchung war, desto länger reagierten die Kälber seropositiv oder fraglich, längstens aber bis zum 121. Lebenstag. Im Pourquier®-ELISA reagierten nur 3 der 6 Kälber positiv, wobei ihr Titer längstens bis zum 60., 63. bzw. 104. Lebenstag im positiven bzw. fraglichen Bereich lag. Zur Evaluierung der DFZM-Ak-Tests an Jung¬rindern wurden weibliche Rinder im Alter von 8 bis 22 Monaten in Abständen von ca. 1-3 Monaten wiederholt serologisch untersucht. Dabei reagierten im DFZM-IgG-Test 6 von 24 Tieren (25 %) in einem MAP-Problem¬betrieb mindestens einmal seropositiv. Aber auch 3 von 10 Jungrindern (30 %) eines zunächst als MAP-unverdächtig eingestuften Betriebs waren jeweils mindestens einmal seropositiv. Im Pourquier®-ELISA reagierten nur je ein Jungrind des MAP-Problem¬betriebes und des MAP-unverdächtigen Betriebes jeweils einmal serologisch fraglich. Nach diesen Ergebnissen ist insbesondere der hier neu etablierte DFZM-IgG1-Test für die MAP-Serodiagnostik an Kälbern und Kühen im Alter von mindestens 2 Jahren sensitiver und spezifischer als 3 derzeit in Deutschland zugelassene ELISAs. Eine humorale Immunreaktion bei Kälbern ist aber auch mit dem DFZM-IgG1-Test frühestens erst 10 Monate nach der Infektion nachweisbar. Ferner kann ein Großteil der Kälber während der ersten 12 Monate selbst mit diesem Test nicht als MAP-infiziert erkannt werden. MAP-spezifische Antikörper maternaler Herkunft können bei Kälbern bis zum ca. 121. Lebenstag eine eigene humorale Immunreaktion vortäuschen, weshalb der Einsatz des DFZM-IgG- oder des DFZM-IgG1-Tests oder des Pourquier®-ELISA zum Nachweis einer aktiven Immunisierung erst ab dem 5. Lebensmonat sinnvoll ist. MAP-spezifische IgG2- oder IgM-Antikörper sind als Parameter einer bestehenden MAP-Infektion nicht (Kälber) oder wenig (Rinder >= 2 Jahre) geeignet. Aufgrund der bei MAP-Infektionen nur verzögert einsetzenden Immunantwort sind wiederholte serologische Untersuchungen erforderlich (z.B. alle 2 Monate ab dem 10. Lebensmonat), um MAP-infizierte Rinder bereits innerhalb der ersten beiden Lebensjahre zu entdecken. Die Früherkennung von MAP-Infektionen mittels serolo¬gischer Verfahren bleibt somit weiterhin eine Herausforderung. Concerning expenditure of time and costs serological assays such as ELISA offer several advantages over methods like faecal culture or PCR tests for the detection of infections with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) in cattle. However, the sensitivities and/or specificities of currently available ELISA tests are limited (Nielsen und Toft, 2008). The aim of this study was to develop and evaluate novel flow cytometry (FC) based assays for the detection of MAP-specific antibodies in bovine serum samples. These FC-Ab assays were supposed to be tested in calves experimentally infected with MAP and in naturally MAP-infected cows in comparison to the Pourquier®-ELISA or direct detection methods.When 22 MAP-free and 18 MAP-shedding cows were examined, the FC-IgG1 assay was more sensitive compared to three ELISA tests currently licensed in Germany. Defining the faecal culture result as gold standard, ROC analysis revealed a sensitivity of 77.8 % at 100 % specificity of the FC-IgG1 assay. Using cut off values set up by manufacturers, sensitivities of the ELISAs were only 61.1 % (Pourquier®-ELISA), 27.8 % (Cattletype®-ELISA), and 27.8 % (Svanovir®-ELISA) at 100 % specificity.In a longitudinal study of experimental infection 6 calves were inoculated orally with 1 x 109 CFU of MAP strain K10. Six mock-infected calves served as controls. Using the novel FC-IgG and the FC-IgG1 assays seroconversion of MAP-specific antibodies were detectable in 2 of 5 MAP-infected calves from 44. or 46. week post infection (w.p.i.) onwards, respectively. Seroconversion of MAP-specific IgG2 or IgM did not occur. Using the Pourquier®-ELISA 5 calves proved seronegative while one calf exhibited questionable results in the last two samples collected at 50. and 52. w.p.i.. Dynamics of MAP-specific maternal antibodies were examined in six calves from seropositive dams and six calves from seronegative dams. After colostrum uptake MAP-specific antibodies were detectable by FC-IgG and FC-IgG1 assay in all 6 calves from seropositive dams. After first detection MAP-specific antibody titers declined continuously. The higher the initial titer the longer calves remained seropositive or exhibited questionable results to a maximum of 121. day of life. Only 3 of these 6 calves proved seropositive or questionable in the Pourquier®-ELISA. ELISA results remained positive or questionable until the 60., 63. or 104. day of life at latest, respectively. In order to evaluate FC-Ab assays with young cattle, female cattle between 8 and 22 months of age were sampled repeatedly in intervals of 1-3 months. Six of 24 tested females (25 %) in a herd with confirmed cases of paratuberculosis proved seropositive by FC-IgG assay at least once during the observation period. However, 3 of 10 females (30 %) in a MAP-unsuspicious herd reacted seropositive at least once as well. Using the Pourquier®-ELISA only one animal in the paratuberculosis herd and one animal in the unsuspicious herd exhibited questionable results; none of the samples yielded positive results. In conclusion, regarding MAP serodiagnosis in calves and adult cattle older than 2 years, the novel FC-IgG1 assay proved more sensitive and specific than 3 licensed ELISA kits. However, even this assay does not allow detection of a humoral immune response to MAP earlier than 10 months after oral ingestion of the pathogen. Additionally, even with this assay the majority of infected calves cannot to be identified during the first 12 months of infection. MAP-specific antibodies of maternal origin persist in the calf until the 121. day of life and can simulate an active immune response. Therefore, application of the FC-IgG or FC-IgG1 assay or the Pourquier®-ELISA is not reasonable before the 5th month of life if active humoral immunization to MAP is to be detected. MAP-specific IgG2- or IgM are no suitable or less suitable indicators of an existing MAP infection in cattle. Due to the delayed and batch-wise onset of immune responses repeated examination (e.g. every 2 months beginning at the age of 10 months) appears reasonable in order to detect MAP infections as early as possible within the first 2 years of life. Early diagnosis of MAP by serology still remains a challenge.