Phäno- und genotypische Charakterisierung von Streptococcus agalactiae (Lancefield-Serogruppe B), isoliert von subklinischen Rindermastitiden

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden 79 Streptococcus agalactiae-Kulturen,isoliert von subklinischen Mastitiden von 54 Kühen aus sieben Milcherzeugerbetrieben des Bundeslandes Hessen, mittels konventioneller sowie molekularer Methoden vergleichend untersucht. Bei den zunächst angewandten Identifizierungsverfahren handelte es sich unter anderem um eine biochemische Differenzierung, die serologische Gruppenbestimmung sowieum den durch Polymerasekettenreaktion (PCR)-vermittelten Nachweis vonspeziesspezifischen Abschnitten der 16S rDNA, der 16S-23S rDNA 'intergenic spacer'- Region und um den Nachweis des CAMP-Faktor-Gens cfb. An die Identifizierung schlossen sich Typisierungsverfahren zur weitergehenden Charakterisierung der S. agalactiae-Kulturen an. Dabei erfolgte eine Unterteilung der Isolate aufgrund spezifischer Polysaccharid- und Proteinantigene in Serotypen, teilweise bestätigt durch PCR-vermittelte Gennachweise. Charakteristisch für die meisten S. agalactiae-Isolatewar das Vorkommen des Proteinantigens X, entweder allein oder in Kombination mit dem Polysaccharidantigen Ia. Bei sechs Kulturen eines Betriebes konnte die Serotypkombination III/Rib nachgewiesen werden. Zwei weitere Isolate eines anderen Betriebes wiesen den Serotyp Ib/calphabeta auf. Die verbleibenden Kulturen waren nicht typisierbar. Weitere phänotypische Merkmale, die eine Unterscheidung der Kulturen der jeweiligen Betriebeermöglichten, waren der Grad der Pigmentierung, das Wachstum der Kulturen inFlüssigmedium und Softagar, die Oberflächenhydrophobizität der Isolate, das Vermögen, Erythrozyten zu agglutinieren sowie das Resistenzverhalten der Isolate gegenüber Tetracyclin und Minocyclin. Die S. agalactiae-Kulturen der verschiedenen Milcherzeugerbetriebe wiesen jeweils identische oder sehr ähnliche Eigenschaften auf. Eine abschließende molekulare Charakterisierung der 79 S. agalactiae-Kulturen erfolgte durch Makrorestriktion der chromosomalen DNA unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen SmaI und ApaI bzw. SalI und anschließender Pulsfeldgelelektrophorese. Die in der vorliegenden Arbeitnachgewiesenen Restriktionsmuster waren innerhalb der einzelnen Betriebe identisch bzw. zeigten nur geringe Abweichungen, während zwischen den Betrieben deutliche Unterschiede der Restriktionsmuster festgestellt werden konnten. Aufgrund der phäno- und genotypischen Eigenschaften der Kulturen der vorliegenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in einzelnen Betrieben ein einzelner S. agalactiae-Stamm bzw. wenige Subtypen dieses Stammes für die jeweilige Mastitissituation verantwortlich zu sein scheinen. In the present investigation 79 streptococcal cultures isolated fromsubclinical mastitis of 54 cattle from seven dairy farms in Hesse, Germany, werecomparatively investigated by using conventional and molecular studies. The cultures were identified as Streptococcus agalactiae, belonging to Lancefield's serological group B by determination of biochemical and serological properties and by polymerase chain reaction (PCR) amplification of species specific parts of the 16S ribosomal DNA, the 16S-23S rDNA intergenic spacer region and the CAMP factor gene cfb. The investigated group B streptococci were further characterized serologically for specific polysaccharide and protein antigens, partly supported by PCR-amplification of the respective genes. Serotyping the isolates revealed a predominance of the surface protein X , either alone or in combination with polysaccharide antigen Ia. Six group B streptococci from one farm displayed the serotype pattern III/Rib. Two isolates from another farm showed the serotype pattern Ib/calphabeta. The remaining cultures were non typable. Additional phenotypic properties which allowed a differentiation of the variouscultures were the grade of pigmentation, the growth properties in fluid media and softagar, the surface hydrophobicity, the ability to hemagglutinate rabbit erythrocytes and the resistance reaction to tetracycline and minocyclin. The isolates of the various farms showed identical or almost identical characteristics. The 79 group B streptococci were additionally investigated by macrorestriction analysis of their chromosomal DNA by using the restriction endonucleases SmaI, ApaI and SalI. The restriction patterns obtained by pulsed-field gel electrophoresis displayed identical or almost identicalpatterns for the cultures of the various farms, respectively, but different patterns for isolates among the various dairy farms. The pheno- and genotypic characteristics of the 79 group B streptococci of the present study revealed that a single S. agalactiae strain or at least closely related subtypes of this strain were responsible for the mastitis situation of the farms, respectively.