Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen des schützenden Proteins Bp1 aus der Mikrofilarienscheide der Filarie Brugia pahangi

Abstract

Filarien (Filarioidea) sind an Arthropoden als Zwischenwirte gebundene Krankheitserreger beim Menschen und bei Tieren. Sie sind vivipar und entlassen die für den Zwischenwirt infektiösen Larven 1 (Mikrofilarien) ins Blut oder in andere Gewebe des Endwirts. Innerhalb der Familie Onchocercidae besteht eine Dichotomie, indem bei einigen Gattungen die Mikrofilarien eine sie allseits umgebende Hülle, die sogenannte Scheide, tragen, während bei anderen Gattungen die Larven frei zirkulieren. Die Scheide entsteht über ein komplexes Zusammenwirken von intrauterinen Embryonalstadien und Uterus-Zellen der weiblichen Filarie und besteht überwiegend aus Proteinen. In der vorliegenden Arbeit wird ein Scheidenoberflächenantigen (Bp1) des Parasiten Brugia pahangi, einer dem Erreger der Lymphatischen Filariose des Menschen B. malayi nahe verwandte Art, dargestellt und mit molekularbiologischen und immunologischen Methoden charakterisiert. Der cDNA-Klon Bp1 (156 bp) wurde nach einer Expressionsklonierung aus einer cDNA-Bank adulter weiblicher B. pahangi mit einem Antiserum gegen den SDS/2ME-unlöslichen Anteil der Mikrofilarienscheide von Litomosoides sigmodontis, also heterologe Scheidenkomponenten, identifiziert. Aus einer genomischen Bibliothek konnte mit dem als Probe fungieren-den cDNA-Klon ein genomischer Klon (gBp1, 10110 bp) isoliert werden. Die Sequenzen der partiellen cDNA und der genomischen DNA sind identisch. Das vollständige Bp1-Gen enthält nach computergestützter Vorhersage fünf Exons und kodiert für ein Polypeptid von 185 Aminosäuren. Die computerunterstützte Homologiesuche in den Datenbanken ergab signifikante Homologien in der sequenzierten genomischen Sequenz. Für die Bp1-cDNA-Sequenz fan-den sich aber weder auf DNA- noch auf Aminosäureebene signifikante Homologien. Die Erkennung mehrerer kreuzreagierender Antigene, die auch in Antigenpräparationen adulter Parasiten und Larven 3 auftreten, lassen vermuten, dass Bp1 nicht stadienspezifisch exprimiert wird. Ein Antiserum gegen das rekombinante b-Galaktosidase-Fusionsprotein erkennt im Immunoblot in adulten Stadien und Mikrofilarien von B. pahangi, B. malayi und L. sigmodontis sowie Larven 3 von B. malayi jeweils bis zu 5 Komponenten im Bereich zwischen 30 kDa und 99 kDa. In B. malayi-Mikrofilarienscheiden wurden Moleküle von 41 kDa und 58 kDa erfasst. Die Ergebnisse sprechen vorab weiterer Analysen für eine gattungs- und stadienübergreifende Expression. Bei adulten weiblichen Filarien reagierte das Antiserum mit Epithelzellen im distalen Uterus. Es wird angenommen, dass Bp1 von diesen Zellen in das Uteruslumen sezerniert und auf die Scheide der herangereiften Mikrofilarien aufgelagert wird, da das Antiserum bei aus dem Blut isolierten Mikrofilarien von B. pahangi, B. malayi und L. sigmodontis an die Scheidenoberfläche bindet. Für eine Lokalisation von Bp1 auf der Scheidenoberfläche sprechen auch die Beobachtungen, dass das Antiserum gegen Bp1 lebende Mikrofilarien der genannten Arten agglutiniert und die Adhärenz von homologen Milzzellen an die Scheidenoberfläche vermittelt. Damit korreliert weiterhin, dass die intravenöse Injektion des Antiserums in mikrofilarämische, B. pahangi- oder L. sigmodontis-infizierte Mastomys coucha zu einem raschen, etwa 5 Tage anhaltenden Abfall der Parasitämie um ca. 50% bzw. 25% führte. Die Untersuchungen sprechen dafür, dass es sich bei Bp1 um ein neues, konserviertes Antigen auf der Scheidenoberfläche von Mikrofilarien handelt, das möglicherweise Bedeutung hat für die Persistenz/Immunelimination der Mikrofilarien im Wirt. Filariae (Filarioidea) are important metazoan pathogens of humans and animals which are transmitted by blood-sucking arthropods. They are viviparous and release first stage larvae (microfilariae) which have to be ingested by the intermediate host. There is a dichotomy within the family Onchocercidae as the microfilariae of some genera are enclosed by a so-called sheath whereas in other genera the microfilariae are released free. Sheath formation is a complex procedure involving both interuterine stages and the uterus epithelium of the female worm. The sheath is a predominantly proteinceous structure which is impermeable for antibodies. Thus it represents an area of interaction between the parasite and the host's immune response. The present thesis describes molecular and immunologic characteristics of a sheath surface protein (Bp1) of B. pahangi, a species which is closely related with B. malayi, a causative agent of human lymphatic filariasis. The cDNA clone Bp1 (156 bp) was identified by immunoscreening of a expression cDNA library of adult female B. pahangi using antibodies to heterologous sheath components, i.e. the SDS/2ME insoluble portion of the Litomosoides sigmodontis microfilariae sheath. Using the clone as a probe a genomic clone (101,10 bp) could be isolated. According to online sequence analysis resources the Bp1 gene contains 5 exons and encodes a polypeptide of 185 amino acids. There are homologies to some filariae EST sequences but there were no relations to known sheath components. An antiserum raised against the recombinant b-galactosidase fusion protein reacted with up to 4 polypeptides of 30 kDa to 99 kDa in adults and microfilariae of B. pahangi, B. malayi and L. sigmodontis and in third stage larvae of B. malayi when tested by immunoblotting. In microfilariae sheaths of B. malayi the antiserum recognized molecules of 41 kDa and 58 kDa. The current results suggest genus and stage overlapping expression. Sections of adult female filariae showed binding of the antibodies to the recombinant protein to epithelial cells of the distal uterus (PAP test). It therefore seems the Bp1 is synthesized by the epithelium of the uterus and accumulates on the sheath. Localization on the sheath surface could be shown by indirect immunoflourescence assays for B. pahangi, B. malayi and L. sigmodontis microfilariae. These data in principle correspond with those reported for other sheath surface components. However, binding of the antibodies could be intensified by pre-treatment of the microfilariae with chymotrypsin. A localization of Bp1 on the sheath surface is also suggested by the agglutination activity of the antiserum to Bp1 and antibody mediated adherence of homologous (rabbit) spleen cells. These observations correlate with the in vivo effects of the antiserum in B. pahangi and L. sigmodontis infected Mastomy coucha: intravenous injection of the antiserum results in a rapid decrease of microfilaraemia levels by approximately 50% and 25%, respectively, which persists for 5-7 days. Thus Bp1 seems to represent a new, conserved antigen of the microfilariae sheath surface which possibly plays a role in persistence/immune-mediated elimination of microfilariae in the host. It is proposed name it Shp6 according to the currently used nomenclatur.