Untersuchungen zu Triggerfaktoren der thrombotisch thrombozytopenischen Purpura (TTP) in Mäusen

Abstract

Die Metalloprotease ADAMTS13 spaltet den VWF im Plasma in kleinere Multimere und verhindert somit eine spontane Thrombozytenbindung an ultralangen VWF. Ein Mangel oder Fehlen dieser Protease führt zum Krankheitsbild der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP), die durch das Auftreten einer hämolytischen Anämie und Thrombozytopenie mit multiplen Mikrothromben charakterisiert ist. Unbehandelt endet eine TTP in 90% der Fälle tödlich. Für die Auslösung der typischen TTP-Symptomatik sind Triggerfaktoren nötig. Einige davon sind bekannt, wie z.B. Infektionen und Medikamente. Der Mechanismus dieser Auslösung ist jedoch noch unbekannt. Um die Pathophysiologie der Erkrankung besser zu erforschen, entwickelten zwei unabhängige Forschergruppen Adamts13-defiziente (Adamts13-/-) Mäuse. Da diese unbehandelt keinerlei Krankheitssymptome zeigen und nur durch den zusätzlichen Einsatz von Triggerfaktoren TTP-typische Laborwerte entwickeln, eignen sie sich gut zur weiteren Erforschung der TTP. Ziel dieser Arbeit war es, ein Mausmodell der TTP zu etablieren und weitere Triggerfaktoren in diesem Mausmodell zu untersuchen. Hierfür wurden Adamts13-/- Mausembryonen aus Japan bezogen und eine Adamts13-/- Zucht aufgebaut. Adamts13 war bei diesen Mäusen weder im Blut noch in Leber und Knochenmark nachweisbar. Blutanalysen der Adamts13-/- Mäuse zeigten keine Unterschiede der Thrombozytenzahlen, der VWF:AG Konzentration, keine Fragmentozyten und keine Veränderung des Hämatokrits im Vergleich zu Wildtyp Mäusen. Durch das Fehlen der Protease im Blut waren UL VWF Multimere messbar und ein prothrombotischer Status konnte mit Hilfe des Kollagen/Epinephrin Thrombose-Modells bestätigt werden, sodass diese Tiere ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Triggerfaktoren der TTP darstellten. Die i.v. Injektion von rhVWF führte bei Adamts13-/- Mäusen innerhalb weniger Minuten zur Entwicklung TTP-typischer Laborwerte, insbesondere zu einer starken Thrombozytopenie, wohingegen Wildtyp Mäuse einen minimalen Thrombozytenabfall zeigten. Ein humanes VWF-Konzentrat, das keine UL VWF Multimere enthält, ebenso wie die endogene Erhöhung des VWFs im Blut der Mäuse durch Histamininjektion, lösten dagegen weder bei den Adamts13-/- noch bei den Wildtyp Mäusen einen Thrombozytenabfall aus. Dies lässt darauf schließen, dass insbesondere die Qualität, aber auch die Quantität des VWFs entscheidend für die Entwicklung eines akuten TTP-Schubes sind.Chinin ist einer der häufigsten medikamenten-induzierten Triggerfaktoren der TTP beim Menschen. In den meisten beschriebenen Fällen führte eine kontinuierliche Einnahme von Chinin gegen nächtliche Wadenkrämpfe zur Entwicklung einer TTP, aber auch die einmalige Aufnahme von Chinin durch Chinin-haltige Getränke kann einen TTP Schub auslösen. Daher wurde sowohl die akute Wirkung hochdosierten Chinins als auch die Langzeitexposition geringer Mengen Chinins in Adamts13-/- und Wildtyp Mäusen untersucht. Beide Versuchsprotokolle zeigten jedoch keinerlei Einfluss des Chinins auf das Allgemeinbefinden und Blutbild der Mäuse.Histone, die eine direkte Thrombozytenaktivierung bewirken und bei TTP-Patienten während akuter Schübe im Blut stark erhöht sind, führten sowohl bei Adamts13-/- als auch bei Wildtyp Mäusen innerhalb weniger Minuten zu einer konzentrationsabhängigen Thrombozytopenie. Diese war überraschenderweise bei niedriger Histonkonzentration bei Wildtyp Mäusen stärker ausgeprägt als bei Adamts13-/- Mäusen. Histone scheinen somit eine untergeordnete Rolle bei der Auslösung akuter TTP-Schübe zu spielen.Die LPS-induzierte akute Lungenschädigung ebenso wie die Infektion mit Aspergillus fumigatus konnten auch keine Thrombozytopenie bei Adamts13-/- Mäusen auslösen, sodass bakterielle Entzündungen und Pilzinfektionen der Lunge wahrscheinlich keine entscheidende Rolle bei TTP spielen. Allerdings zeigte sich hierbei eine schlechtere Immunantwort der Adamts13-/- Mäuse auf die Entzündung, was eine antiinflammatorische Wirkung von ADAMTS13 vermuten lässt. The plasma metalloprotease ADAMTS13 cleaves ultralarge VWF into smaller multimers thereby preventing spontaneous platelet binding to VWF. Gradual reduction or deficiency of ADAMTS13 leads to Thrombotic Thrombocytopenic Purpura (TTP), a disease characterized by haemolytic anemia, thrombocytopenia and multiple microthrombosis. Without treatment TTP leads in 90% to death. Special triggers are needed for the onset of this disease. Some of them are well known, such as infections and some drugs. The underlying mechanism, however, of these triggers are not known so far. Two independent research groups developed Adamts13-deficient (Adamts13-/-) mice to investigate the pathophysiology of this disease. These mice are suitable to test trigger factors as they do not show any TTP Symptoms in untreated condition. Aim of this study was to establish a mouse model for further investigations on trigger factors of TTP. Therefore, frozen Adamts13-/- mouse embryos where purchased from Japan to built up an Adamts13-/- mouse breed. Adamts13 was not detectable neither in blood nor in liver or bone marrow tissue of these mice. Analysis of blood showed no differences in platelet counts, VWF antigen concentration, haematocrit or schistocytes between Adamts13-/- and wildtype mice. Loss of Adamts13 led to appearance of ultralarge VWF multimers and a prothrombotic status in a collagen/epinephrine model in these mice. Intraveneous infection of rhVWF causes TTP typical symptoms in Adamts13-/- mice within minutes especially profound thrombocytopenia. In contrast, wildtype mice showed only a minimal platelet decrease. Not only a human VWF concentrate without ultralarge VWF multimers but also the endogenous increase of VWF by histamine injections did not provoke thrombocytopenia neither in Adamts13-/- nor in wildtype mice. From this follows that mainly the quality but also the quantity of VWF is critical for the onset of an acute TTP episode.Quinine is one of the most important drug-induced trigger factors for TTP in humans. A continuous Quinine intake against nocturnal leg cramps is one of the most cited reasons for drug induced TTP. A single intake of Quinine containing beverages can also evoke an acute TTP episode. Seeing that, the acute effect of a single high dose administration and the long term effect of continuous low dose Quinine administration was investigated in Adamts13-/- and wildtype mice. Both protocols showed no influence of Quinine on the general condition and blood cell counts in wildtype and knockout mice. To infer from that, Quinine induced thrombocytopenia seems to be an immune thrombocytopenia without an important influence of ADAMTS13.Histones directly activate platelets and it was shown that their concentration is significantly increased during acute TTP episodes in patients. In mice histones induce profound thrombocytopenia in Adamts13-/- and wildtype mice within minutes. Intriguingly, injections of low histone concentrations caused distinct platelet decrease in wildtype mice in comparison to Adamts13-/- mice showing a subordinate role for histones in TTP episodes.Lung aspergillosis as well as LPS induced acute lung injury did also not trigger thrombocytopenia in Adamts13-/- mice concluding bacterial and fungal infections of the lung are less relevant for TTP. However, these infections uncovered a reduced immune response of Adamts13-/- mice to infections leading to the hypothesis of an anti-inflammatory role of ADAMTS13.