Die Bedeutung von Entzündungszellen und Zytokinen für die Regression des kaninen kutanen Histiozytoms

Abstract

Gegenstand der Arbeit ist das kanine kutane Histiozytom, ein benigner histiozytärer Hauttumor, der besonders häufig bei jungen Hunden auftritt und bei dem in der Regel innerhalb weniger Wochen eine Spontanregression eintritt. Als Ursprungszellen dieser Neoplasie wurden die Langerhans-Zellen der Haut, die zu der Reihe der dendritischen Antigen-präsentierenden Zellen gehören, identifiziert. Ziel der Arbeit war es, festzustellen, ob die Regression des Histiozytoms durch ein spezifisches Zytokinmuster und das Auftreten bestimmter Entzündungszellpopulationen im Tumorgewebe, gekennzeichnet ist. Weiterhin sollte ermittelt werden, inwieweit Stickstoffmonoxid (NO) und Tumorzell-Apoptose eine Rolle bei der Tumorregression spielen. In der Literaturübersicht wird der aktuelle Kenntnissstand zur Pathologie des kaninen kutanen Histiozytoms und eine Übersicht über weitere histiozytäre Proliferationen des Hundes wiedergegeben. Außerdem werden die Mechnismen der Immunantwort gegen Tumoren kurz erläutert und Beispiele für Spontanregression bei natürlich auftretende Tumoren genannt. In die eigenen Untersuchungen wurden 30 Histiozytome einbezogen, die nach Menge und Muster der lymphozytären Infiltration in 4 Gruppen unterteilt wurden. Hierbei wurden Tumorgruppen mit zunehmend stark ausgeprägten entzündlichen Veränderungen unterschieden, die die Stadien der fortschreitenden Tumorregression repräsentieren sollen. Zunächst wurde eine immunhistologische Charakterisierung der Tumor-infiltrierenden Entzündungzellen in den verschieden Gruppen vorgenommen. Die Subpopulationen der infiltrierenden Lymphozyten wurden mit spezifischen Antikörpern gegen CD3-, CD21(like)-, CD4- und CD8-Antigen an Gefrierschnitten immunhistologisch identifiziert und die durchschnittliche Zellzahl pro Flächeneinheit ermittelt. Tumor-infiltrierende Makrophagen wurden an Hand von Lysozym und meyeloischem/histiozytärem Antigen dargestellt und auf gleiche Weise quantifizert. Mit der TUNEL-Methode wurde der apoptotische Index ermittelt. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde mRNA aus Gefrierschnitten der Histiozytome isoliert und die Expression von ausgewählten Zytokinen (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF alpha, IFN gamma, TGF beta) und der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) durch Reverse Transkription und anschließende semiquantitative real-time PCR untersucht. Die immunhistologischen Untersuchungen ergaben einen signifikanten Anstieg der T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und der Makrophagen im Verlaufe der Regression. Der Vergleich der Lymphozyten-Subpopulationen zeigte, dass die Anzahl der T-Lymphozyten gegenüber den B-Lymphozyten in allen Gruppen stark überwog. Die Differenzierung von zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen ergab, dass beide Zellpopulationen zu Beginn der Regression in gleichem Maße vertreten waren. Erst mit Zunahme der lymphozytären Infiltration kam es zu einer Dominanz der zytotoxischen T-Zellen und somit zu einer signifikanten Änderung des CD4/CD8 Quotienten. Die Quantifizierung der TUNEL-positiven Zellen ergab keine relevanten Änderungen des apoptischen Index innerhalb der Tumorgruppen. Die Ergebnisse der semiquantitativen real-time PCR zeigten einen signifikanten Anstieg der Expression von IL-2, TNF alpha, IFN gamma und iNOS mit Zunahme der Entzündungszell Infiltration. Bei den Zytokinen IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 und TGF beta ergaben sich keine signifikanten Unterschiede innerhalb der Regressionstadien. Die Ergebnisse zeigten eine relativ hohen Anteil an T-Helferzellen zu Beginn der Tumorregression. Dies bestätigt die Bedeutung dieser Zellen für die Antigenerkennung und Induktion der Immunantwort. Die Zunahme der infiltrierenden Entzündungszellen war mit einem signifikanten Anstieg der Expression von IL-2, IFN gamma, TNF alpha assoziiert. Durch die Aufregulation dieser Th1-Zytokine könnten die Effektorfunktionen der zellulären Immunantwort maßgeblich unterstützt werden und die Lyse von Tumorzellen in die Wege leiten. So konnte eine signifikante Zunahme von meyeloischem/histiozytärem Antigen-positiven Zellen und ein Anstieg der iNOS mRNA im Verlaufe der Regression festgestellt werden, was auf eine Aktivierung von Tumor-infiltrierenden Makrophagen hinweist. Daraus könnte man schließen, dass nicht nur die zahlreich vorhandenen zytotoxischen T-Zellen im Rahmen der spezifischen Immmunität einen Anti-Tumor-Effekt ausüben, sondern auch Makrophagen als Zellen der natürlichen Immunität zur Reduktion der Tumormasse beitragen. Subject of the investigation is the canine cutaneous histiocytoma, a benign histiocytic tumor that most commonly occurs in young dogs und usually displays spontaneous regression within few weeks. The epidermal Langerhans cells, which belong to the lineage of dendritic antigen-presenting cells are identified as the origin of this neoplasm. The aim of this study was to determine whether the regression of canine cutaneous histiocytoma is associated with the expression of a distinct cytokine profile and with the presence of certain inflammatory cells. Furthermore, the role of nitric oxide (NO) and tumor cell-apoptosis for tumor regression was elucidated. The pathology of canine cutaneous histiocytoma as well as the current classification of other histiocytic tumors are reviewed. Furthermore, the mechanisms of anti-tumor immunity are briefly discribed and exampels for spontaneous regression of naturally occurring neoplasms are given. 30 histiocytomas were included in this study. The tumors were devided into 4 groups according to the number and distribution of infiltrating lymphocytes. Tumor groups were distinguished by the increasing degree of inflammatory alterations to represent various stages of ongoing regression. Tumor-infiltrating inflammatory cells were characterized by immunohistochemistry. Different subpopulations of infiltrating lymphocytes were identified on frozen tissue sections using specific antibodies against CD3-, CD21(like)-, CD4- or CD8- antigen and the average number of positiv cells per square unit was determined. Tumor-infiltrating macrophages were detected by lysozym- or myeloid/histiocytic antigen-immunoreactivity in paraffin-embedded sections and quantified as mentioned above. The TUNEL-method was used to compare the apoptotic index of histiocytomas in the different groups. In the second part of the study, mRNA was isolated from frozen tissue sections and the expression of certain cytokines (IL-1, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF alpha, IFN gamma, TGF beta) and inducible NO-Synthase (iNOS) was messured by semiquantitative real-time PCR following reverse transcription. Immmunohistochemistry revealed a significant increase in the number of T-cells, B-cells and myeloid/histiocytic antigen-positiv cells during tumor regression. The comparison of the different lymphocytes subsets revealed that far more T-cells than B-cells were detectable in all groups. Cytotoxic T-cells and T-helpercells were both present in equal numbers at the beginning of tumor regression, whereas cytotoxic T-cells became the dominant cell type with increase of inflammatory infiltration, leading to a significant change in the CD4/CD8 ratio. The quantification of TUNEL-positiv cells revealed no significant changes of the apoptotic index within the different groups. The results of the semi-quantitative real-time PCR showed an up-regulation of the expression of IL-2, TNF alpha, IFN gamma and iNOS with the increase of infiltrating inflammatory cells. For IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 und TGF beta no signifikant differences between the stages of regression were observed. The high proportion of T-helper cells at the beginning of tumor regression underlines the importance of these cells in antigen recognition and induction of tumor regression. The increased number of infiltrating inflammatory cells was associated with a significant increase of IL-2-, TNF alpha- and IFN gamma-expression. The up-regulation of these Th1- cytokines could support celluar immunity and possibly mediate tumor cell lysis. Furthermore an increase of myeloid/histiocyte antigen-positive cells and an increase of iNOS mRNA was detected. The latter could indicate an activation of tumor-infiltrating macrophages and suggests that in addition to tumor-specific cytotoxic lymphocytes also macrophages as cells of the innate immunity could contribute to the reduction of the tumor mass.