Populationsgenetische Untersuchungen an slowakischen Braunbären mit Hilfe mitochondrialer und nukleärer DNS

Abstract

Ziel dieser Arbeit war eine populationsgenetische Untersuchung der slowakischenBraunbärenpopulation, die Anfang der 30er Jahren einen Flaschenhals mit nur noch 20 bis 40Tieren durchlief. Die Population erholte sich dank rigoroser Schutzmaßnahmen relativ schnellund beinhaltet nun ca. 650 Tiere. Die Untersuchung fand anhand zweier Abschnitte dermitochondrialen DNS und dreier Mikrosatelliten der Kern-DNS statt. Es wurde mittels PCR ein 515 bis 520 bp großer Abschnitt aus dem D-loop und ein 307 bpgroßer Abschnitt aus dem Cytochrom-b-Gen amplifiziert und anschließend sequenziert.Im D-loop wurden als einzige genetische Variation Längenunterschiede im sogenannten T -und C-Stretch , die unmittelbar aufeinander folgen, entdeckt. Es wurden Haplotypen mit 4,5, 6 oder 8 Thyminbasen und 6, 7 oder 8 Cytosinbasen gefunden. Bei den meisten deruntersuchten Bären ließ sich an diesem DNS-Abschnitt Heteroplasmie, verursacht durch dieungewöhnlich hohe Mutationsrate in diesem Bereich, beobachten.Im Cytochrom-b-Gen wurden zwei Haplotypen gefunden, die sich an Basenposition 225 desuntersuchten Abschnitts (Position 294 des Cytochrom-b-Gens) durch eine A/G-Transitionvoneinander unterscheiden (0,37% Divergenz). Es wurden drei verschiedene Mikrosatelliten (CAN 7, G10B, G10L) untersucht, indem siemittels PCR amplifiziert, auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und mitradioaktiver Markierung sichtbar gemacht wurden. Der Mikrosatellit CAN 7 war vorher nurbeim Hund benutzt worden und wurde hier erstmalig bei Braunbären verwendet. Er zeigtezwei verschiedene Allele und drei Genotypen, die erwartete Heterozytie betrug 0,305 und diebeobachtete Heterozygotie 0,25. Bei Mikrosatellit G10B wurden drei Allele, fünf Genotypen,eine erwartete Heterozygotie von 0,6192 und eine beobachtete Heterozygotie von 0,6875gefunden, bei Mikrosatellit G10L acht Allele, 11 Genotypen, eine erwartete Heterozygotievon 0,703 und eine beobachtete Heterozygotie von 0,84375. Diese Werte liegen im Vergleichzu anderen Populationen, insbesondere mit den relativ ungestörten nordamerikanischenBraunbärvorkommen, im Normalbereich. Die durchschnittliche Anzahl von Allelen propolymorphem Locus ist mit 4,33 leicht erniedrigt. Es konnten bei diesen Untersuchungen weder ein Zusammenhang zwischen Genotyp undgeographischer Distanz der Bären zueinander festgestellt werden, noch war einZusammenhang zu geographischen Barrieren, wie z. B. Straßen, dichtbesiedelten Gebieten,Tälern etc. ersichtlich. Verwandtschaftliche Verhältnisse der Braunbären untereinanderkönnten zu der teilweise beobachteten örtlichen Häufung einiger Genotypen geführt haben.180 Im europäischen Vergleich konnten für den D-loop die Untersuchungsergebnisse andererAutoren bestätigt und somit die Einordnung der slowakischen Braunbären in dengesamteuropäischen Zusammenhang als zur östlichen genetischen Linie gehörigvorgenommen werden. Die Sequenz des Cytochrom-b-Gens war beim slowakischenBraunbären noch nicht untersucht worden und wies im Vergleich zu Braunbären derwestlichen genetischen Linie (Bären aus Italien, Kroatien und den Pyrenäen) eine relativgroße Sequenzdivergenz von 4,56 bis 4,98 % auf, die aber erwartungsgemäß etwas kleiner istals im D-loop (bis zu 7,11 %). In der mtDNS wurde eine reduzierte genetische Variabilität festgestellt, die ihren Grund indem Bottle neck hat, den die Population in den 30er Jahren durchlief. Die besondere Fähigkeitder mtDNS zur Aufdeckung von Bottle necks, Fragmentation und Isolation von Populationenwird durch diese Untersuchung bekräftigt. Untersuchungen der Mikrosatelliten sind dazuweniger geeignet. In einer weiteren Untersuchung wurde geprüft, ob die DNS von Futtertieren im Kot vonBraunbären nachzuweisen ist. Der Bärenkot stammte von zwei Braunbären des Kölner Zoosund wurde nach Anwendung eines Fütterungsschemas, in dessen Rahmen nur Pferdefleischals tierische Eiweißquelle gefüttert wurde, mittels PCR und anschließenderRestriktionsenzymanalyse mit dem Restriktionsenzym HaeIII untersucht. Dabei konnte nurPferde-DNS nachgewiesen werden. Der Anteil an Braunbären-DNS muss daher nach der PCRunter 10 % des gesamten DNS-Gemisches betragen haben. Die DNS der Futtertiere ist also imBärenkot nicht nur nachzuweisen, sondern kann darin auch den größten Anteil ausmachen.Dies kann genetische Analysen stören, so dass als Konsequenz dieser Ergebnisse beigenetischen Studien über Braunbären anhand von Bärenkot bärenspezifische Primerverwendet werden müssen. Andererseits ist es möglich, die Ernährungsgewohnheiten derBären anhand ihres Kotes zu untersuchen. Aim of this study was to investigate the genetics of the Slowakian brown bear at thepopulation level. This population suffered from a severe bottle neck in the early 30ies withonly 20 to 40 animals left. Due to rigorous protection efforts the population recoveredrelatively fast up to a number of currently about 650 individuals. The analysis was performedon two regions of the mitochondrial DNA and three microsatellite loci of the nuclear genome.Using PCR 515 to 520 base pairs of the d-loop and 307 base pairs of the cytochrome-b-genewere amplificated and sequenced afterwards. The only genetic variation detected in the d-loop was a variation in length in the t- and cstretch.The t-stretch is directly connected to the c-stretch. There were haplotypes with 4, 5, 6or 8 thymine bases and 6, 7 or 8 cytosine bases. In most of the investigated brown bearsheteroplasmy in this DNA region was found, which has its reason in an extremly highmutation rate in the t- and c-stretch. In the cytochrome-b-gene there were found two haplotypes, which differed at the position 225of the examined region ( position 294 of the cytochrome-b-gene) by an A/G-transition (0,37%divergence). Three different microsatellite loci (CAN7, G10B, G10L) were analysed. They wereamplificated with PCR, separated on a polyacrylamide gel by electrophoresis and labelled byradioactivity to make them visible. The microsatellite locus CAN 7 was developed for canineDNA and was used the first time in brown bears here. It showed two different alleles andthree genotypes, the expected heterozygosity was 0,305, the observed heterozygosity 0,25. Inthe microsatellite G10B there were found three alleles and five genotypes, the expectedheterozygosity was 0,6192 and the observed heterozygosity 0,6875, in the microsatelliteG10L there were eight alleles, eleven genotypes, an expected heterozygosity of 0,703 and anobserved heterozygosity of 0,84375. These results demonstrate that the nuclear DNA geneticdiversity of Slowakian brown bears is not low on the basis of these three microsatellites. It iscomparable to diversity levels observed in relatively undisturbed North Americanpopulations. In these investigations no correlation of the genotype to the geographical distance of the bearscould be seen, neither could be found an association to geographical barriers, like for examplelarge streets, regions with high human population density, valleys etc. Familiar relationshipscould have lead to the local accumulation of single genotypes.182 The present sequence analysis of the d-loop is consistent with findings in other Europeanbrown bear populations. The sequence of the cytochrome-b-gene was not yet investigated inthe Slowakian brown bear before. The sequence divergence to bears of the western geneticlineage was relatively high (4,56-4,98 %). As expected, it was lower than the differencebetween the eastern and the western lineage in the d-loop (up to 7,11 %), though. In themitochondrial DNA there was found a reduced genetic variability, which resultated from theearlier bottle neck. The specific ability of mitochondrial DNA to show bottle necks,fragmentation and isolation of a population, which are not visible in investigations withmicrosatellites, is underlined in this study. In a further investigation was tested, whether the DNA from feeding animals could be foundin the droppings of brown bears. The droppings were sammpled from bears of the ZooCologne and was examined after feeding the bears with horse meat as the only vertebrateprotein source for a few days by PCR and restriction-fragment-length-analysis with therestrictionenzyme HaeIII. It could only be proofed the presence of equine DNA. The portionof brown bear DNA after the PCR could not have been more than 10 % of the DNA-mixture.The DNA of the feeding animals can not only be found in the droppings of the brown bear,but can be the largest portion. That can cause problems in genetic ananlyses that are carriedout with the droppings of brown bears, so there should be used bear specific primers. At theother hand it is possible to study the feeding habits of brown bears by their droppings in thefuture.