Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung von Neuronen des parasympathischen Ganglion sphenopalatinum der transgenen Mauslinie MOL2.3-IGITL

Abstract

Olfaktorische Rezeptorproteine (OR) gehören zur Superfamilie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren, wobei einige der transmembranalen OR nicht nur in chemosensorischen, primären Sinneszellen des olfaktorischen Epithels, sondern auch in anderen Geweben nachweisbar sind. So ermöglichte die Co-Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) mit dem kürzlich identifizierten OR MOL2.3, einem orphan Rezeptor mit unbekanntem endogenen bzw. exogenen Liganden, in der transgenen Mauslinie MOL2.3-IGITL die molekularbiologische und fluoreszenz-mikroskopische Lokalisation des MOL2.3-Genprodukts zunächst in spezifischen, olfaktorisch sensorischen Neuronen der murinen Riechschleimhaut. GFP-positive Zellen konnten zusätzlich in distinkten Arealen des Hirnstammes (Area postrema, Nucleus tractus solitarii) sowie in umschriebenen Zellpopulationen cranialer und thorakaler Ganglien des Sympathikus (Ganglion cervicale craniale, Ganglia cervico-thoracica) bzw. Parasympathikus (Ganglion sphenopalatinum) demonstriert werden. Zielgewebe, welche efferent von Neuronen des parasympathischen Ganglion sphenopalatinum (SPG), inklusive zahlreichen, das MOL2.3-Gen exprimierenden Zellen, innerviert werden, sind die lateralen Nasendrüsen, die Harder´schen Drüsen sowie bestimmte Segmente cranialer Blutgefäße.Die Transkription eines OR-Gens wie MOL2.3 in ganglionären Einheiten des autonomen Nervensystems wirft nun die Frage nach (1) der möglichen Funktion dieses orphan Rezeptors in den exprimierenden Zellen, bzw. (2) möglicherweise unterschiedlichen funktionellen Charakteristika MOL2.3-positiver versus MOL2.3-negativer Ganglienzellen der Maus auf. In der vorliegenden Arbeit konnte zunächst demonstriert werden, dass der MOL2.3-Rezeptor - identifiziert über den co-exprimierten histologischen Marker GFP - in etwa 50 Prozent aller SPG-Neurone der MOL2.3-IGITL Maus exprimiert wird. Der gleichzeitige, fluorometrische Nachweis zweier Antigene ermöglichte die detaillierte, immunhistochemische Analyse der murinen, SPG-intrinsischen und GFP-positiven Neurone und die Erarbeitung ihres zellspezifischen 'Neurotransmitter-Coding'. So ergab sich eine signifikante Co-Lokalisation des orphan Rezeptors mit den cholinergen Markerproteinen Cholin-Acetyl Transferase (ChAT, >90 %) und vesikulärer Acetylcholin Transporter (VAChT, 90 %), sowie der neuronalen Stickstoffmonoxid Synthase (nNOS, 75 %) als generierendem Enzym des volatilen Botenstoffs Stickstoffmonoxid (NO). Zahlreiche dieser als nitrerg, cholinerg oder cholinerg/nitrerg klassifizierbaren MOL2.3-positiven Neurone erwiesen sich darüber hinaus als cholinerg innerviert, sei es auf klassisch efferente oder retrograd auto- bzw. pararegulatorische Art und Weise. Einige GFP-positive Neurone des SPG neonataler Mäuse co-exprimierten die peptidergen Neuromodulatoren Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) bzw. Substanz P (SP). In funktionellen, zellphysiologischen Versuchsansätzen - durchgeführt an Kurzzeit-kultivierten Ganglienzellen des murinen SPG - sollte mittels mikrospektrofluorometrischer Ratio-Imaging Technik (Fura-2) die Bedeutung der immuncytochemisch nachgewiesenen endogenen Neurotransmitter/-modulatoren für die intrazelluläre Signaltransduktion vergleichend in MOL2.3-positiven und -negativen Neuronen ermittelt, und die Daten miteinander verglichen werden. In vitro Untersuchungen an MOL2.3-positiven wie -negativen Zellen konnten für beide Zelltypen eine dosisabhängige, wiederholbare und nicht desensibilisierbare Stimulierbarkeit mit Acetylcholin nachweisen, wobei der Anstieg der intrazellulären Calcium-Konzentration ([Ca2+]iz) auf dem Einstrom extrazellulären Calciums in die Zelle beruhte. Mit Subtyp-spezifischen, cholinergen Rezeptoragonisten konnten die Acetylcholinrezeptoren (AChR) als überwiegend nicotinerg definiert werden, wobei einzelne Zellen zusätzlich muscarinerge AChR exprimierten. Die nicotinergen AChR der MOL2.3-positiven und -negativen Zellen ließen sich als homomere α7 Rezeptoren klassifizieren, diejenigen der MOL2.3-negativen Zellen zusätzlich als heteromere α3β4 Proteine. Nach cholinerger Stimulation der Zellen strömte extrazelluläres Calcium zum einen durch die genannten nAChR Subtypen ins Zytoplasma, zum Teil auch durch sekundär geöffnete, spannungsabhängige Calciumkanäle des L-Typs, wie mit Co-Stimulationen durch selektive Calciumkanal-Blocker demonstriert werden konnte. Die repetitive Superfusion der Zellpräparationen mit Acetylcholin bei Ausschluss einer Desensibilisierung der Zellen ermöglichte weiterhin eine detaillierte Charakterisierung der cholinergen Signaltransduktion MOL2.3-positiver und negativer Zellen im Hinblick auf eine etwaige modulatorische Rolle von NO oder PACAP. Stimulation mit den potenten NO-Donoren DEA und Nor-1 per se aktivierten ebenso eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade, bestimmt durch den Anstieg der [Ca2+]iz. Co-Stimulationen der Zellen mit Acetylcholin und DEA zeigten darüber hinaus, dass freigesetztes NO einen transient hemmenden Einfluß auf die cholinerge Aktivierung der MOL2.3-positiven Zellen, nicht aber der MOL2.3 negativen Zellen bewirkte. Diese Beobachtung könnte mit der Expression des MOL2.3-Rezeptors in direktem Zusammenhang stehen. Olfaktorische Rezeptoren können, wie auch NO selbst, cGMP-vermittelt unspezifische Kationenkanäle aktivieren, woraufhin sekundär die Aktivität des nAChR vermindert wird. Etwa die Hälfte der ganglionären Zellen erwies sich als responsiv für das Neuropeptid PACAP, welches im Unterschied zu NO - zudem eine Hemmung der Zellantwort auf Acetylcholin in beiden, nicht nur den MOL2.3-positiven Neuronentypen induzierte. Diese Hemmung dürfte auf einer Desensibilisierung der α7 nAChR durch PACAP beruhen. Das Neuropeptid PACAP könnte im Rahmen der Zell-spezifischen Funktionen des SPG z.B. die Sensitivität nicotinerger AChR, die Freisetzung von Acetylcholin, oder mittels Aktivierung von Calciumkanälen des L-Typs die NO-Synthese modulieren. Die ganglionären Neuronen zeigten sich als nicht-responsiv für Noradrenalin und Glutamat. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass zwischen den hier charakterisierten Transmittersystemen des Ganglion sphenopalatinum der neonatalen Maus komplexe hemmende wie auch aktivierende Interaktionen möglich sind. Der MOL2.3-Rezeptor könnte demzufolge im Ganglion sphenopalatinum eine essentielle Rolle bei adaptiven neuronalen Prozessen spielen und die Zellen so vor Stimulation mit zu starken Stimuli schützen. Olfactory receptor proteins belong to the superfamily of G-protein coupled receptors. Certain members of the transmembranal olfactory receptor group appear to be expressed not only in chemosensory neurons of the olfactory epithelium but also in other tissues. In the transgenic mouse line MOL2.3-IGITL, a recently identified olfactory receptor gene encoding an orphan receptor with yet unknown endo- or exogenous ligand is co-expressed with green-fluorescent protein (GFP). Employing expression of GFP as histologically identifiable marker protein, the MOL2.3 gene product can be detected in olfactory sensory neurons of the mouse nasal epithelium. GFP-positive cells can additionally be localized in distinct areas of the brainstem (area postrema, nucleus tractus solitarius) and cell populations within certain sympathetic (cervical cranial and cervicothoracic ganglia) and parasympathetic (sphenopalatine ganglion) cranial and thoracic ganglia. Target tissues innervated by sphenopalatine ganglionic cells in general are the lateral nasal glands, the Harderian glands and distinct sections of cranial blood vessels. All these tissues receive input from MOL2.3 gene expressing sphenopalatine ganglionic cells. Transcription of an olfactory receptor gene like MOL2.3 in neurons of the autonomic nervous system raises the interesting question about (1) a putative functional role of the encoded orphan receptor protein in these cells and (2) different functional characteristics of MOL2.3-positive versus negative ganglionic cells. Within the autonomic sphenopalatine ganglion of newborn mice, some 50 % of all ganglionic cells express the orphan olfactory receptor MOL2.3, detectable via GFP-positive immunofluorescence. Neurochemical transmitter coding reveals distinct patterns of MOL2.3 co-localization preferentially with choline acetyl transferase (ChAT >90 %), vesicular acetylcholine transporter (VAChT 90 %) as well as neuronal nitric oxide synthase (nNOS 75 %). High numbers of these nitrergic, cholinergic or cholinergic/nitrergic MOL2.3-positive neurons receive innervation from cholinergic cells, whether of classical efferent or auto- e.g. pararegulatory origin. A few MOL2.3 positive neurons also express pituitary adenylate cyclase activating peptide (PACAP) and substance P (SP). In functional, cell physiological approaches, using the ratio imaging method (fura-2), the role of the immunohistocemically detected endogenous neurotransmitters/-modulators for intracellular signal transduction should be defined and compared between MOL2.3-positive and negative cells. In vitro signal transduction studies of MOL2.3-positive as well as negative cells revealed dose-dependent, repetitive and non-desensitizing rises in intracellular calcium concentration due to stimulation with acetylcholine (ACh). The rise in intracellular calcium was based on extracellular calcium influx. The ACh receptors (AChR) in the sphenopalatine ganglionic cells predominantly belonged to the nicotinergic subtype whereas some cells additionally expressed muscarinic receptors. The nicotinic acetylcholine receptors (nAChR) of the MOL2.3-positive cells proved to be of the α7 subtype; in MOL2.3-negative cells the subunit-compositions α3β4 as well as α7 were expressed. Co-stimulation experiments with selective calcium channel blockers demonstrated, that after cholinergic stimulation calcium entered the cytosol through nAChR as well as secondary opened L-type calcium channels. Repetitive superfusion of the cell preparation with acetylcholine at 10-4 M/l excluded desensitisation phenomena and allowed detailled characterization the cholinergic signal transduction in MOL2.3 positive and -negative cells with regard to the putative modulatory role of NO or PACAP. Stimulation with the potent nitrergic substances DEA and Nor-1 also activated an intracellular signal transduction cascade, which finally resulted in an increase in intracellular calcium. Co-application of ACh and DEA led to significantly reduced elevations in intracellular calcium as compared to cholinergic stimulation without NO in MOL2.3-positive but not -negative cells. These observations could be linked to the expression of the MOL2.3-receptor. Olfactory receptors are, as NO per se, able to activate cyclic nucleotide gated cation channels in a cGMP-dependent manner, followed by decreased activity of nAChR. About half of the ganglionic cells proved responsive to stimulation with the neuropeptide PACAP. PACAP caused an inhibition of the cholinergically induced cellular responses, which was seen not only in MOL2.3-positive but also -negative cells. This inhibition could be the result of a desensitisation of α7 nAChR by PACAP. However, PACAP might be involved in various cellular functions. For example it could in- or decrease the nAChR-sensitivity or the liberation of ACh. Via activation of L-type calcium-channels PACAP could further induce or increase NO-synthesis. The ganglionic neurons did not respond to norepinephrine or glutamate. Summarizing the results of this study there are different, inhibitory as well as activating interactions between the different transmitter-systems in the murine sphenopalatine ganglion. The MOL2.3-receptor might play an essential role in adaptive neuronal processes to protect the cells against strong stimuli.