Entdeckung und Charakterisierung einer neuen Genfamilie, SBFDCP7, bei Vertebraten und Bakterien

Abstract

Die SBF-Proteindomäne (Sodium Bile acid symporter Family domain) kommt in zwei bereitscharakterisierten Proteinfamilien vor, SLC10 und ACR3. Die ersten charakterisierten Mitglieder derSLC10-Familie sind die natriumabhängigen Gallensäuretransporter NTCP (SLC10A1) und ASBT(SLC10A2). Beide Transporter sind essentiell an der Aufrechterhaltung des enterohepatischenKreislaufs der Gallensäuren beteiligt. In den letzten zwei Jahren wurden am Institut fürPharmakologie und Toxikologie vier neue Mitglieder (SLC10A3 bis 6) dieser Proteinfamilieidentifiziert. Eines dieser Mitglieder, der SOAT (SLC10A6), transportiert keine Gallensäuren,sondern sulfatierte Steroide. Damit wurde offensichtlich, dass nicht alle Mitglieder der SLC10-Familie Gallensäurentransporter sind, was das bisherige Verständnis von der Familie derGallensäuretransporter grundlegend veränderte. Mitglieder der ACR3-Familie wurdenausschließlich in Hefen und Bakterien identifiziert und vermitteln einen Arsenit-resistentenPhänotyp. In der vorliegenden Arbeit wird ein neues Protein, genannt P7, von Mensch, Ratte,Maus und Frosch beschrieben. Diese Proteine wurden kloniert und charakterisiert. P7-Gene sindin 12 Exonen organisiert und bilden zahlreiche Transkriptionsvarianten. Drei dieser Variantenwurden in dieser Arbeit bei Mensch und Maus nachgewiesen und kloniert (P7 Variante 1 bis 3 beiMensch und Maus). Die Variante 1 und 3 von Maus und 1 von Mensch verändern nicht dasLeseraster, während Variante 2 und 3 von Mensch und 2 von Maus dies tun und zur Bildungvorzeitiger Stop-Codons und dadurch C-Terminal-trunkierter Proteine führen. P7-Gen wird imKörper sehr breit exprimiert, besonders stark in Herz, Gehirn, Leber, Milz, Dickdarm, Dünndarmund Nebenniere. P7-Proteine bestehen aus 340-343 Aminosäuren und zeigen über 85 %Sequenzidentität untereinander. Durch heterologe Expression in X. laevis-Oozyten wurdenradioaktiv markierte Gallensäuren (Taurocholat, Cholat und Chenodeoxycholat), Steroidsulfate(Estron-3-sulfat, Dehydroepiandrosteronsulfat und Pregnenolonsulfat), Eicosanoide (ProstaglandinE2 und Leukotriene C4), Digoxin und Estron-17ß-Glucuronid getestet. Allerdings konnte keineTransportaktivität für die getesteten Substanzen nachgewiesen werden. Durch strategischeingebaute HA- und FLAG-Epitope und anschließende Immunfluoreszenz wurde für P7 eineMembrantopologie von 10 Transmembrandomänen mit einem intrazellulär lokalisierten N- und CTerminusbewiesen. P7 ist ein Protein von 27 kDa bei Mensch und Ratte und ist in derPlasmamembran lokalisiert. Der N-Terminus von P7 wird proteolytisch nicht gespalten. Weil P7 das 7. Säugetierprotein ist, welches die SBF-Domäne enthält, wurde es als SBFDCP7 Sodium Bile acid Family Domain Containing Protein 7 bezeichnet. Neben den Vertebraten-Proteinen wurden zahlreiche SBFDCP7-verwandte Sequenzen von Bakterien, Pflanzen undHefen, die noch nicht charakterisiert worden sind, identifiziert. Die phylogenetische Verwandtschaftder SBF-Familie wurde analysiert. Unter der SBF-Familie existieren drei gut definierteUnterfamilien: ACR3, SBFDCP7 und SLC10. Zu den Mitgliedern der SLC10- und ACR3-Familie haben SBFDCP7 weniger als 15 % Sequenzidentität. Im Gegensatz dazu zeigen Vertebraten- undBakterien-SBFDCP7 eine höhere Sequenzidentität (> 20 %). Damit hat die SBFDCP7-Familie dieBesonderheit, im Gegensatz zu der SLC10- und ACR3-Familie, in allen drei Zweigen der belebtenNatur vorzukommen, nämlich in Pflanzen, Bakterien und tierischen Lebewesen. SBFDCP7-Proteine zeigen eine vergleichbare Länge und Membrantopologie sowie zahlreiche konservierteProteindomänen von E. coli bis Mensch, was auf eine konservierte physiologische Funktionhindeutet.Mit dieser Arbeit sind die grundlegenden genomischen und biochemischen Erkenntnissen zudieser Proteinfamilie sowie die Expression von vier neuen Proteinen aufgeklärt worden. Ebensoliegen in dieser Arbeit die ersten phylogenetischen Daten dieser neuen Proteinfamilie SBFDCP7vor. There are two well-characterized protein families, which contain the SBF protein domain (SodiumBile acid symporter Family domain): SLC10 and ACR3. NTCP (SLC10A1) and ASBT (SLC10A2)are well-known sodium-dependent bile acid transporters. These carriers are essentially involved inthe maintenance of the enterohepatic circulation of bile acids. In addition to NTCP and ASBT, werecently identified further members of the SLC10 family: SLC10A3 to A6. After the cloning of SOAT(SLC10A6), which specifically transports steroid sulfates but not bile acids it became evident thatnot all SLC10 members are bile acid transporters. The second SBF-family is referred to as ACR3and is comprised of genes from bacteria and yeasts, which confer an arsenic-resistant phenotype. In this Ph.D. thesis a new protein, named P7, from man, rat, mouse, and frog, was cloned andcharacterized. P7 genes are organized in 12 exons and code numerous alternatively splicedtranscription variants. Three variants from man and mouse were here identified and cloned. Variant1 and 3 from mouse and variant 1 from man do not alter the open reading frame, whereas variant 2and 3 from man and 2 from mouse conduct to premature stop codons and thus to C-terminaltruncated protein isoforms. P7 genes are broadly expressed, among others, in heart, brain, liver,spleen, colon, small intestine, and adrenal glands. P7 proteins consist of 340-343 amino acids andhave an overall sequence identity of > 85 %. P7 proteins were expressed heterologous in X. laevisoocytes and uptake studies with radioactive labelled bile acids (taurocholate, cholate, andchenodeoxycholate), steroid sulfates (estrone-3sulfate, dehydroepiandrosterone sulfate, andpregnenolone sulfate), eicosanoids (prostaglandine E2 and leucotriene C4), digoxine, and estrone-17ß-glucuronide, were conducted. However, no transport activity could be detected for thesecompounds. With strategically inserted HA- and FLAG-epitopes and immunofluorescencemicroscopy a membrane topology of 10 transmembrane domains was demonstrated strengtheningthat both N- and C-terminus are intracellularly localized. P7 are membrane proteins of 27 kDa inman and rat. The N-terminus is not splitted off by proteolysis. Because P7 represents the 7thmammalian protein, which contains the SBF-domain, it was named SBFDCP7 Sodium Bile acidFamily Domain Containing Protein 7. Phylogenetic relationships of the SBF-Family were analyzed. There are three well-defined SBF subfamilies among the SBF-family, e.i. ACR3, SBFDCP7, andSLC10. Compared with SLC10 and ACR3 family members SBFDCP7 show < 15 % sequenceidentity. By contrast, vertebrates and bacteria SBFDCP7 are more identical (> 20 % sequenceidentity). In contrast to SLC10 and ACR3 families, members of the SBFDCP7 family exist withinthe three branches of living organisms, namely in bacteria, plants, and animals. P7 proteins fromE. coli to man show a similar length and membrane topology as well as many conserved proteindomains. Therefore, a conserved physiological function of P7 is assumed. In this Ph.D. thesis theunderlying genomic and biochemical knowledge of four new SBF proteins were clarified. Also, thefirst phylogenetical relationships of the new protein family SBFDCP7 are presented in this study.