Validierung der Wirksamkeitsprüfung für Clostridium tetani Impfstoffe ad usum veterinarium durch den direkten Nachweis von Tetanus-Antitoxin im Zieltier mittels ELISA

Abstract

Die dargelegten Ergebnisse zur Validierung einer neuen Wirksamkeitsprüfung von Tetanus-Impfstoffen resultieren aus umfangreichen Feldstudien, durchgeführt mit neun unterschiedlichen Impfstoffen für das Pferd sowie acht Impfstoffen für das Schaf. Insgesamt wurden 102 Pferde und 82 Schafe entsprechend den Angaben in der Gebrauchsinformation immunisiert. Blutentnahmen fanden nach einem vorgegebenen Schema von bis zu zwei Jahren nach der ersten Impfung statt. Die Impfstoffe waren entweder monovalent oder enthielten zusätzlich eine Influenzakomponente (Pferd) oder weitere Clostridienantigene sowie Antigene von Mannheimia haemolytica und Pasteurella trehalosi (Schaf). Im Ganzen konnten 564 Pferdesera und 257 Schafsera von geimpften Tieren auf ihren Tetanus-Antitoxin-Gehalt untersucht werden. Dazu wurde mit der vorliegenden Arbeit eine speziesunabhängige in vitro-Methode, der Doppel-Antigen ELISA, zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Tetanus-Antitoxin-Titern in Pferde- und Schafsera entwickelt und auf ihre Eignung geprüft. Ergänzend, zur vergleichenden Einordnung und Kontrolle der Ergebnisse, wurden die Sera in einem weiteren, anti-Spezies-Konjugat-abhängigen indirekten ELISA getestet. Das Prinzip des Doppel-Antigen ELISA (DAE) beruht darauf, dass die Tetanus-Antikörper das Tetanustoxoid an zwei unterschiedlichen antigenen Determinanten binden. Damit wird der Test im Bereich niedriger Antikörperspiegel besonders spezifisch. Genau in diesem Bereich müssen relevante Aussagen über den Schutzstatus (neutralisierende Antikörper) getroffen werden. Die Nachweisgrenze von Tetanus-Antikörpern liegt hier im Bereich von 10-4 EE/ml. Der Vergleich von Werten einzelner Sera mit den im Mausneutralisationstest (MNT) ermittelten Ergebnissen ergab, dass Pferdesera mit einem Wert von 0,04 bzw. 0,05 EE/ml im DAE im Neutralisationstest eine Wertigkeit von größer 0,05 IE/ml bzw. 0,034 IE/ml aufwiesen und damit von der Tendenz her eine gute Übereinstimmung zeigten. Bei den Schafsera, die im Neutralisationstest mit > 0,05 IE/ml bewertet wurden, betrug der entsprechende Wert im DAE 0,24 EE/ml. Die Untersuchungen der Pferdegruppen ließen einen offensichtlichen Unterschied in der Antitoxinbildung gegen verschiedene Impfstoffe nach der zweiten Immunisierung erkennen, der statistisch allerdings nicht als signifikant zu sichern war. Eine Korrelation zwischen Lf-Gehalt im Impfstoff und dem im Tier induzierten Antitoxin-Titer konnte nicht festgestellt werden. Dagegen waren in den Schafgruppen nach der Grundimmunisierung durchaus statistisch signifikante Unterschiede in der Antitoxinbildung zwischen einzelnen Impfstoffen zu verzeichnen. Konsequenterweise könnte der Toxinneutralisationstest, der im Rahmen der Zulassung von Tetanus-Impfstoffen bislang angewandt wurde, durch den Doppel-Antigen ELISA ersetzt werden. Damit würde man auch den Anforderungen des Arzneibuches bezüglich der Verwendung von Tieren entsprechen, wonach einer Methode der Vorzug zu geben ist, die die Ablösung eines Tierversuches ermöglicht. Darüberhinaus erführe das Laborpersonal eine Entlastung durch den Wegfall der materiell aufwendigen Tierversuche und dem damit verbundenen Umgang mit dem Tetanustoxin. The presented results of the validation of a new method for testing the efficacy for tetanus vaccines follow from substantial field trials carried out with nine different equine vaccines as well as eight different vaccines of sheep. Overall, 102 horses and 82 sheep have been immunised according to the instructions for use. Blood collections have been carried out according to the stated schedule up to two years after the first immunisation. Either the vaccines were monovalent or additionally contained an influenza component (horse) or contained further clostridial antigens as well as antigens of Mannheimia haemolytica and Pasteurella trehalosi (sheep). All together, 564 horse sera and 257 sheep sera of immunised animals have been examined for their tetanus antitoxin content. For this purpose a species-independent in vitro method, the double antigen ELISA, for qualitative and quantitative verification of the tetanus antitoxin titers in horse and sheep sera has been developed and examined to verify the suitability of the method. In addition, for comparative classification and control of the results the sera have been examined in a further system, a species-conjugate dependent indirect ELISA. Thanks to the principle of the double antigen ELISA, the tetanus antibodies are forced to bind to different antigen determinants. Therefore the test is very specific especially for low antibody titres, i.e. that area which is relevant for a judgement of the protective status (neutralising antibodies). The detection limit of tetanus antibodies is in the order of 10-4 EU/ml. A comparison of results of individual sera showed that horse sera with contents of 0.04 and 0.05 ELISA Units (EU)/ml during testing in the DAE showed values of > 0.05 International Units (IU) and 0.034 IU/ml respectively in the mouse neutralisation test (in vivo) thus showing good agreement. For tested sheep sera which were rated > 0.05 IU in vivo, the corrresponding value in the DAE was 0.24 EU/ml. A discrepancy in the generation of tetanus antitoxin within the different horse groups was obvious following the second immunisation. However, a statistical significance was not given. A correlation between the Lf content of the vaccine and the induced antitoxin titer in the animal was unascertainable. In contrast a statistical significant difference in the induction of tetanus antitoxin by different vaccines could be observed within the sheep groups after the basic immunisation. With the double antigen ELISA, efficacy can be determined within the marketing authorisation. As a consequence, the toxin neutalisation test would have to be replaced, since it requires too great a number of animals per test and involves considerable suffering for the animals. The test described here reduces the use of mice and guinea pigs within vaccine testing. In addition, it involves less exposure of the lab personal to toxin.