Einfluss verschiedener Leukozyten und von Zellkulturüberständen auf die zytotoxische Aktivität von aus Hundeblut isolierten Effektorzellen

Abstract

1.Im Literaturteil wird ein kurzer Überblick über Morphologie und Funktion von Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) sowie den Mechanismus ihrer Zytotoxizität gegeben. Da im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von anderen Leukozytenarten auf die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen untersucht werden sollte, erfolgen zunächst Angaben bezüglich der Isolierung von Lymphozyten aus Blut, sowie der Depletion kontaminierender Leukozytenarten, speziell von Monozyten sowie CD4+- und CD8+-Zellen. Auch die Messmethode der zytotoxischen Aktivität der im Isolat enthaltenen Zellen wird kurz dargestellt. Außerdem wird der bisher bekannte Einfluss einzelner Leukozytenarten auf die Zytotoxizität beschrieben. 2.Die beim Menschen bereits beschriebene und besonders ausgeprägte zytotoxische Aktivität sogenannter adhärenter NK-Zellen (A-NK) wird diskutiert. Um einen Einfluss der Adhärenz an Plastikoberflächen auf Zellzusammensetzung und Zytotoxizität zu untersuchen, wurde jeweils vor und nach der Depletion plastikadhärenter Leukozyten sowohl ein Zytotoxizitätstest als auch eine Bestimmung der relativen Zellanteile durchgeführt. Dabei stellten sich die relativen Anteile isolierter Lymphozyten und neutrophiler Granulozyten nach Adhärenz nahezu unverändert dar. Monozyten und eosinophile Granulozyten zeigten jeweils eine Reduktion ihres relativen Zellanteils nach Adhärenz. Diese erwies sich allerdings nur hinsichtlich der eosinophilen Granulozyten als statistisch schwach signifikant (p = 0,02). Die von einigen Autoren beschriebene effektive Monozytendepletion durch Adhärenz bestätigte sich nach den hier vorliegenden Ergebnissen für den Hund nicht. Bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 50:1 konnte nach Adhärenz eine statistisch signifikante Reduktion der zytotoxischen Aktivität um knapp die Hälfte beobachtet werden (p = 0,01). Dies könnte ein Hinweis auf die Existenz adhärenter NK-Zellen beim Hund sein, da bei Differenzierung der adhärenten Zellen Lymphozyten nachgewiesen werden konnten. Eine mögliche Beteiligung anderer adhärenter Zellen (beispielsweise Monozyten und eosinophile Granulozyten) an der spontanen zytotoxischen Aktivität ist aufgrund dieser Ergebnisse zwar nicht sicher auszuschließen, direkte Hinweise darauf konnten allerdings nicht ermittelt werden. 3.Zur Erzielung einer effektiveren Monozytendepletion wurde die Adhärenz mit einer Carbonyleisenzugabe zu den isolierten Zellen kombiniert. Mit einem p-Wert von p = 0,007 stellte sich die auf diesem Weg erreichte weitere Reduktion der Monozyten zwar als signifikant heraus, eine vollständige Monozytendepletion konnte allerdings auch hierdurch nicht erzielt werden. Ein signifikanter Einfluss der Carbonyleisenphagozytose auf die relativen Anteile der anderen isolierten Leukozytenarten, nämlich von Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten konnte nicht nachgewiesen werden. Bei dem Vergleich der zytotoxischen Aktivität ohne bzw. nach Zugabe des Carbonyleisens ergab sich ein statistisch nicht signifikantes Absinken der Zytotoxizität von 20,2 % nach alleiniger Adhärenz auf 10,9 % nach kombinierter Adhärenz und Carbonyleisenphagozytose. Ob diese Reduktion nur durch Monozyten oder auch durch neutrophile bzw. eosinophile Granulozyten bedingt ist, kann aufgrund vorliegender Ergebnisse nicht sicher beantwortet werden. 4.Die Depletion CD4+-Zellen erfolgte mittels immunomagnetischer Separation. Dabei wurde der spezifische Antikörper Rat anti-Dog CD4 eingesetzt. Die Depletion von CD4+-Zellen resultierte in einer signifikanten Erniedrigung der Gesamtleukozytenzahl, die allerdings nicht nur auf eine Depletion CD4+-Zellen zurückzuführen ist. Vielmehr müssen auch andere Leukozytenarten bei der Depletion verloren gehen. Eine unspezifische Bindung dieser Zellen an Dynabeads® mit ihrem bereits gekoppelten Sekundärantikörper Sheep anti-Rat konnte in Vorversuchen ausgeschlossen werden. Ob der Zellverlust auf eine Adhärenz der Leukozyten an der Oberfläche des verwendeten Zentrifugenröhrchens zurückzuführen ist, konnte nicht geklärt werden. Ein Einfluss CD4+-Zellen auf die Zytotoxizität konnte bei keinem untersuchten Effektor-Zielzellverhältnis beobachtet werden. Die Zytotoxizität stellte sich vielmehr im Vergleich vor und nach Depletion CD4+-Zellen nahezu unverändert dar (p > 0,05). Dieses Ergebnis weist klar darauf hin, dass CD4+-Zellen nicht an der Auslösung der spontanen zytotoxischen Aktivität beim Hund beteiligt sind. 5.Nach immunomagnetischer Separation von CD8+-Zellen mittels eines an Dyna¬beads® Sheep anti-Mouse gekoppelten spezifischen Antikörpers (Mouse anti-Dog CD8) konnte ebenfalls eine signifikante Reduktion der Gesamtleukozytenzahl beobachtet werden. Diese Reduktion ist allerdings nicht nur auf eine Depletion CD8+-Zellen zurückzuführen, sondern wie bei der Depletion CD4+-Zellen gingen auch andere Leukozytenarten bei dieser Methode verloren. Die Ermittlung der zytotoxischen Aktivität erfolgte bei unterschiedlichen Effektor-Zielzellverhältnissen. Bei einer E/T ratio von 100:1 konnte dabei gegenüber CTAC-Zellen ein nicht signifikanter Anstieg der zytotoxischen Aktivität nach Depletion CD8+-Zellen um den Faktor 1,5 beobachtet werden. Bei Untersuchung der Effektor-Zielzellverhältnisse 50:1 und 25:1 konnte jedoch kein bzw. nur ein geringgradiger, nicht signifikanter Anstieg der zytotoxischen Aktivität verzeichnet werden (p > 0,05). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass CD8+-Zellen ebenfalls keinen bedeutenden Einfluss auf die spontane Zytotoxizität von kaninen NK-Zellen nehmen. Der bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 beobachtete Anstieg der Zytotoxizität ist vermutlich auf eine Anreicherung der Effektorzellen im Isolat zurückzuführen. Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass beim Hund die spontane Zytotoxizität im Wesentlichen auf NK-Zellen beruht. 6.Nach Koinkubation von Ziel- und Effektorzellen konnte keine zytotoxische Aktivität von löslichen zytotoxischen Faktoren im Zellkulturüberstand nachgewiesen werden (p = 0,002). Demzufolge ist beim Hund ein direkter Zell-zu-Zellkontakt zwischen Ziel- und Effektorzellen für die Auslösung der spontanen Zytotoxizität von entscheidender Bedeutung, lösliche zytotoxische Faktoren im Zellkulturüberstand spielen hierbei offenbar keine Rolle. 7.Da alle in vorliegender Arbeit nach der Percoll®-Isolierung angewendeten Aufreinigungsverfahren mit einem hohen Zellverlust einhergehen, sollte überprüft werden, ob eine weitere Aufreinigung der Percoll®-isolierten Effektorzellen für den Einsatz im Zytotoxizitätstest überhaupt sinnvoll ist. Zwischen dem Anteil isolierter Lymphozyten und der Höhe der Zytotoxizität ergab sich weder bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 noch bei einer E/T ratio von 50:1 ein statistisch gesicherter Zusammenhang (p > 0.05). Inwieweit ein Nutzen aus zusätzlichen Aufreinigungsverfahren, die signifikant mit einer Reduktion der Gesamtleukozytenzahl verbunden sind, gezogen werden kann, muss daher je nach Untersuchungsziel überdacht werden. Zumindest ist bei einer starken Kontamination der isolierten Lymphozyten mit anderen Leukozytenarten das Effektor-Zielzellverhältnis nur schlecht einzustellen, da als Effektorzellen in erster Linie die Gruppe der Lymphozyten mit den darin enthaltenen NK-Zellen entscheidend sind. 8.Weiterhin wurde der in der Literatur diskutierte Einfluss äußerer Faktoren auf die zytotoxische Aktivität untersucht. Dazu wurde die jeweils mittlere zytotoxische Aktivität von Klinikhunden, die unter standardisierten Bedingungen gehalten wurden, mit der von Hunden aus privatem Besitz bei einem Effektor-Zielzellverhältnis von 100:1 bzw. 50:1 direkt nach Percoll®-Isolierung verglichen. Die Privathunde wiesen bei einer E/T ratio von 100:1 mit einem p-Wert von 0,003 eine signifikant höhere mittlere Zytotoxizität auf (60,1 % im Vergleich zu 28,7 %). Auch bei der E/T ratio von 50:1 zeigten die Privathunde eine geringgradig höhere mittlere Zytotoxizität, die sich allerdings als nicht signifikant darstellte. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Haltung und möglicherweise damit verbundene Stressfaktoren der Tiere einen Einfluss auf das Immunsystem und auf die spontane zytotoxische Aktivität nehmen. Das für den Menschen beschriebene Low-NK-Syndrom, welches mit erniedrigter NK-Aktivität einhergeht und häufig bei deprimierten und gestressten Personen auftritt, könnte somit auch beim Hund vorkommen. 1.The morphology and function of natural killer cells (NK cells) as well as their killing mechanisms and the determination of NK cell activity is described shortly. Furthermore, information about lymphocyte isolation from canine blood, depletion methods of contaminating leucocytes, especially concerning monocytes, CD4+ and CD8+ cells, is given. The function of these leucocytes as well as their influ¬ence on spontaneous cytotoxicity, as far as it is known, is described. 2.The possible role of adherent NK cells (A-NK), which are reported to show an especially high cytotoxic activity in humans, is discussed and examined in this study. Therefore, of each Beagle dog the total blood cell numbers and differential blood counts as well as the spontaneous cytotoxic activities of the isolated cells were determined prior to and after incubation in plastic culture dishes. Although depletion of adherent cells had no effect on lymphocytes and neutrophilic granulocytes, a reduction in the relative cell counts of monocytes and eosinophilic granulocytes could be observed after adherence to plastic surfaces. However, only the number of eosinophilic granulocytes was reduced significantly (p = 0.02) after plastic adherence. A significant depletion of monocytes through plastic adherence, which is often described in literature, could not be demonstrated in the pr¬sent study for the dog. At an effector to target cell ratio of 50:1 the spontaneous cytotoxic activity was sig¬nificantly reduced by almost 50 % (p = 0.01) after adherence to plastic surfaces. These results suggest that adherent cells with cytotoxic activity (NK cells) also exist in dogs, due to lymphocytes being recognized in the adherent cell fraction. Nevertheless, monocytes and eosinophilic granulocytes showed adherence to plastic surfaces, too, and may therefore also be responsible for the observed reduction in cytotoxic activity. 3.Since in the present study monocytes could not be depleted sufficiently by plastic adherence, this method was combined with phagocytosis of carbonyl iron by the isolated cells. This way a significant reduction of monocytes could be achieved (p = 0.007), although monocytes were not depleted completely. The relative cell numbers of lymphocytes, neutrophilic and eosinophilic granulocytes were not significantly influenced by carbonyl iron phagocytosis. The cytotoxic activity was not significantly reduced from a mean cytotoxic ac¬tivity of 20.2 % after plastic adherence to a mean cytotoxic activity of 10.9 % after depletion of adherent and phagocytosing cells, which could be due to either mono¬cytes, neutrophilic granulocytes or eosinophilic granulocytes. 4.Depletion of CD4+ cells was carried out by immunomagnetic separation with Dynabeads® Sheep anti-Rat coupled with the specific monoclonal antibody Rat anti-Dog CD4. Depletion of CD4+ cells resulted in a significantly decreased absolute cell count, which can not only be due to the depletion of CD4+ cells, since other leucocytes are reduced as well. No unspecific binding of these cells to Dynabeads® Sheep anti-Rat could be observed, though. Whether the cell loss has to be attributed to an adherence of leucocytes to the glass surface of centrifugation tubes, cannot be answered in the present study. In the present study no difference in cytotoxic activity prior to and after depletion of CD4+ cells could be observed (p > 0.05), indicating CD4+ cells are not involved in spontaneous cytotoxic activities in dogs. 5.After immunomagnetic separation of CD8+ cells with Dynabeads® Sheep anti-Mouse, coupled with the specific monoclonal antibody Mouse anti-Dog CD8, a significantly decreased absolute cell count could be observed, which again as described for CD4+ cells cannot only be due to the depletion of CD8+ cells. At an effector to target cell ratio of 100:1 the cytotoxic activity against CTAC cells increased not significantly 1.5 times. Concerning the effector to target cell ratios 50:1 and 25:1 no or only a slight increase of the cytotoxic activity could be observed (p > 0.05). These results suggest CD8+ cells do not influence the cytotoxic activity of canine NK cells significantly. The observed, not significant increase of cytotoxicity at an effector to target cell ratio of 100:1 may rather be due to an enrichment of effector cells in the isolated cell suspension. Altogether, the results of the present stu¬dy indicate spontaneous cytotoxic activity in the dog is basically induced by NK-cells. 6.Additionally, a cytotoxic activity of supernatants produced in a cytotoxicity assay, which is often described in literature, was examined. Nevertheless, no such cy¬to¬toxic activity could be observed in the present study (p = 0.002). Therefore, in dogs a direct cell-to-cell contact between effector and target cells is crucial to induce cytotoxicity in target cells. 7.Since all described isolation and depletion methods resulted in a signifi¬cant reduction of the absolute cell count, a correlation between the relative lymphocyte cell count (including NK cells) and the mean cytotoxicity of the effector cells measured after Percoll® isolation was examined. In the present study no such correlation was observed, though, neither at an effector to target cell ratio of 100:1 nor at an effector to target cell ratio of 50:1 (p > 0.05). Nevertheless, inaccuracies in the effector to target cell ratios due to contamina¬ting cells should always be considered. 8.Finally, the mean cytotoxicity after Percoll® isolation of Beagle dogs living in private households was compared to that of Beagle dogs living in standardized conditions. At an effector to target cell ratio of 100:1 dogs living in private households showed a mean cytotoxicity of 60.1 %, which was significantly higher than the cytotoxic activitity measured in dogs living in standardized conditions (28.7 %, p = 0.003). At an effector to target cell ratio of 50:1 dogs living in private households again showed a slightly increased cytotoxic activity, which was not significant this time, though. These results suggest that living conditions (e.g. stress) may influence the immune system and spontaneous cytotoxic activity. Therefore, a low NK syndrome , which in humans often occurs in depressed and stressed persons and is cha¬racterized by persistently low NK activity, might also exist in dogs.