Untersuchungen zur Expression von Connexin (Cx)43 und Connexin (Cx)45 in Sertoli Zellen und Keimzellen in der normalen Spermatogenese, Sertoli Zelltumoren und Seminomen des Hundes

Abstract

Im Hoden treten zwischen den unterschiedlichen Zellpopulationen verschiedene Möglichkeiten zur interzellulären Kommunikation auf. Neben parakriner und endokriner Kommunikation spielt dabei die direkte zelluläre Kommunikation über GJ-Kanäle eine sehr wichtige Rolle. Das GJ-Protein Cx43 ist das vorherrschende Cx im Hoden der meisten Spezies und wird von Sertoli Zellen, Spermatogonien, Spermatozyten, peritubulären Zellen und interstitiellen Leydig Zellen exprimiert. Im Keimepithel des Meerschweinchens und des Nerzes wird Cx43 erstmals mit Beginn der Spermatogenese und mit Bildung der funktionellen Blut-Hoden-Schranke exprimiert und kann in diesen Tierarten als pubertärer Differenzierungsmarker der Sertoli Zelle verwendet werden. Es scheint für die terminale Differenzierung der Sertoli Zellen, die kontrollierte Interaktion und Kommunikation zwischen Sertoli Zellen und Keimzellen und die pubertäre Initiation der Spermatogenese erforderlich zu sein. In neoplastischen humanen Hoden wird Cx43-Protein, einhergehend mit Sertoli Zelldedifferenzierung während Keimzelltumor- und Sertoli Zelltumorentwicklung, herunterreguliert. Der Hund wurde wegen des relativ häufigen Autretens testikulärer Neoplasien als Tiermodell im Vergleich zu Studien des männlichen Reproduktionstraktes vorgeschlagen. Das GJ-Protein Cx45 wird zwischen Herzmuskelzellen und Zellen der glatten Muskulatur exprimiert. Im Hoden konnte Cx45-mRNA in Tubuli seminiferi von Nagern gefunden werden. Cx43 und Cx45 können oft im gleichen GJ-Plaque kolokalisiert sein. Sie bilden im Herzen heteromerische GJ-Kanäle, wobei es assoziiert mit ventrikulären Arrhythmien zu einer Herunterregulierung von Cx43 und einer Hochregulierung von Cx45 kommt. In der gegenwärtigen Studie wurde das mögliche Vorkommen von Cx43-mRNA und -Protein im Hoden von präpubertären Hunden, adulten Hunden mit normaler Spermatogenese und in verschiedenen Formen testikulärer Tumore, mit Hilfe von Immunhistochemie, Western Blot, RT-PCR aus Gewebehomogenat und aus mikrodissezierten Zellen und In-situ Hybridisierung, untersucht. Zudem wurde das mögliche Auftreten von Cx45-mRNA und -Protein im Hoden von adulten Hunden mit normaler Spermatogenese, mit Hilfe von Immunhistochemie, Western Blot und RT-PCR aus Gewebehomogenat ermittelt. Cx43-mRNA konnte in allen untersuchten caninen testikulären Geweben detektiert werden. Bemerkenswerterweise synthetisieren Sertoli Zellen in präpubertären Keimsträngen nur geringe Mengen an Cx43-Protein, was eine Rolle von Cx43-Protein bei der Initiierung der Spermatogenese annehmen lässt. In Tubuli seminiferi des adulten Hundes war Cx43-Protein zwischen Sertoli Zellen und zwischen Sertoli Zellen und Keimzellen des Sertoli-Sertoli cell junctional complex lokalisiert, was auf seine Rolle bei der Erhaltung der Spermatogenese deutet. In caninen Hodentumoren zeigte sich ein unterschiedliches Verteilungs- und Expressionsmuster. Cx43 Protein konnte nur zwischen neoplastischen Sertoli Zellen in Sertoli Zelltumoren detektiert werden. Es fehlte zwischen neoplastischen Keimzellen in Seminomen, was auf eine unterschiedliche Regulation in testikulären Tumoren schließen lässt. Wenn man die hohe Frequenz des Auftretens von Hodenkrebs in Hunden betrachtet und ihre Ähnlichkeiten oder Unterschiede im Vergleich zu humanen testikulären Neoplasien, könnten zukünftige vergleichende pathogenetische Studien canine Keimzelltumoren mit einbeziehen. Cx45 mRNA konnte mittels RT-PCR in allen untersuchten caninen testikulären Geweben detektiert werden. Erste Ergebnisse auf Proteinebene im Hoden des adulten Hundes zeigten, dass Cx45 zwischen peritubulären Zellen lokalisiert ist, woraus sich schließen lässt, dass Cx45 ein weiteres Mitglied der Cx Familie zu sein scheint, und im Hoden des Hundes exprimiert wird. In the testis, intercellular communication is regulated through certain mechanisms between different cell populations. The direct communication via gap junction channels plays, among paracrine and endocrine communication, an important role. The gap junctional protein Cx43 is known to be expressed by Sertoli cells, spermatogonia, spermatocytes, peritubular cells and interstitial Leydig cells and represents the predominant Cx in the testis of most species. Cx43 is known to be first expressed with the onset of spermatogenesis and formation of the blood-testis-barrier in the seminiferous epithelium of guinea pig and mink and may be a useful functional pubertal differentiation marker for Sertoli cells. It is supposed to be necessary for the terminal differentiation of Sertoli cells, the controlled interaction and communication between Sertoli and germ cells, and the pubertal initiation of spermatogenesis. In neoplastic human testis, Cx43 gene expression and Cx43 protein synthesis were found to be reduced together with a Sertoli cell dedifferentiation during seminoma and Sertoli cell tumor development. The dog has been proposed as a model for studies of the male reproductive system, because of the occurrence of testicular neoplasms in relative high frequency. Cx45 expression is known to occur between cardiac myocytes and smooth muscle cells. In the testis, Cx45 mRNA could be found in rodent seminiferous epithelium. Cx43 and Cx45 can often be colocalized in the same gap junctional plaque. In the heart, they form heteromeric gap junction channels and, associated with ventricular arrhythmias, Cx45 protein is found to be up-regulated in conjunction with down-regulation of Cx43. In the present study, the possible occurrence of Cx43-mRNA and -protein in testes of prepubertal dogs, adult dogs with normal spermatogenesis and in different forms of testicular tumors was investigated, using immunohistochemistry, western blot, RT-PCR from tissue homogenate and from microdissected tubules and in-situ hybridization. Moreover, the possible occurrence of Cx45-mRNA and -protein in testes of adult dogs was investigated, using immunohistochemistry, western blot and RT-PCR. Cx43 mRNA was detected in all investigated canine testicular tissues. Remarkably, Sertoli cells in prepubertal cords do only synthesize small amounts of Cx43 protein, supposing a role of Cx43 protein in the initiation of spermatogenesis. In seminiferous tubules of the adult dog, Cx43 protein was localized between Sertoli cells and between Sertoli cells and germ cells of the Sertoli-Sertoli cell junctional complex, indicating its role in the maintenance of spermatogenesis. In canine testicular tumors a different distribution and expression pattern was shown. Cx43 protein was only detectable between neoplastic Sertoli cells in Sertoli cell tumor. It was absent between neoplastic germ cells in seminoma, indicating that Cx43 is regulated differentially in testicular tumors. Considering the high frequency of testicular cancer in dogs and their similarities or extremes to human testicular neoplasms, future comparative pathogenetic studies may also include canine seminoma. Cx45 mRNA was detected by RT-PCR in all investigated canine testicular tissues. Preliminary results in testis of the the adult dog reveal that, Cx45 protein was localized between peritubular cells, indicating that Cx45 seems to be another member of the connexin family to be expressed in canine testis.